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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 Phenol chloroform precipitation 어떻게 하는 건가요?
알우으앙(대학원생)  |  02.18 16:31

Restriction enzyme reaction 후에 gel elution으로 뽑았는데 loss가 많다고 PCI를 이용해서 하라고 하셔서 하는데 실험이 실패한 거 같아서 다시 제한효소 처리 중입니다 ㅠ

제한효소 처리한 plasmid 총 80ul를 d.w를 넣어서 500ul로 맞추고 PCI를 500ul 넣어서 1ml를 만든 후에 원심분리를 8000rpm으로 5분 하고 반복을 두 번 더 하라고 하는데

이때 상층액은 얼마 정도 뽑아야 하나요? 최종 supernatant를 450ul 뽑으면 된다길래 그렇게 하려고 했는데 자꾸 밑에 층에 팁이 닿더라고요... 그래서 점점 더 적게 옮길수록 마지막에 450ul 따는 건 불가능할 거 같은데...

그리고 마지막에 450ul 따면 총 볼륨 10%가 되게 50ul 3M NaOAc를 넣고 1ml 95% ethanol을 섞고 영하 80도 30분 보관하고 원심분리 12000rpm 30분하고 70% ethanol washing 하고 말린 후에 물 넣으면 된다는데 450ul 따는 과정까지 어떻게 해야 성공할 수 있나요? 반복하는 과정에서는 그냥 밑에까지 팁 안에 들어와도 신경 안 쓰고 반복해서 aqueous solution의 양을 늘린다는 느낌으로 하는 건가요?

#DNA
 
#phenol
 
#chloroform
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.18 16:43  

페놀층이 안들어오게 최대한 많은 양의 수층을 회수하면 됩니다.

알우으앙  |  02.18 21:48  
반복하는 과정에서도 페놀층이 들어가면 안 되나요?
개구리Marine  |  02.18 22:52  

PCI 를 넣고 spin-down 후 상층액을 취하는 것을 반복하는 과정에서

가장 마지막에 상층액 취하는 단계 (Precipitation 하기 위한 상층액) 에서
가장 세심하게 중간층을 건드리지 않고 상층액을 취하시면 됩니다.


즉, 마지막 단계에서만 세심하게 파이펫팅 하신다면, 그 이전 단계에서는 중간층이 조금 들어온다고 해도 크게 영향을 미치지 않습니다.

만약 마지막 단계에서 정한 용량인 450일 취할경우 중간층이 무너질 것 같다면,
그냥 450 이 안되더라도 거기서 파이펫팅을 멈추셔야 Purity 가 떨어지지 않습니다. 

대왕개구리SPEED  |  02.18 23:06  

페놀이 들어가면 침전 시 페놀층 위에 DNA가 침전되어 상등액 버릴 때 DNA를

회수 할수 없습니다. 

또한 침전이 된다고 해도 페놀이 극미량이라도 남아있으면 대부분의 실험에

사용할 수 없습니다.

psw9176@khu.ac.kr  |  02.19 13:48   

감사합니다...

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