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질문 Hemolysis Assay
올챙이z크핫z(대학생)  |  02.18 14:20

안녕하세요 제가 채혈 후에 AMP Peptide로 Hemolysis Assay를 사용하려고 합니다.

우선 제가 찾아본 Protocal은 다음과 같습니다.

1)Erythrocyte were isolated from mouse blood cells (1ml)
2)Moved into e-tude
3)Centrifuge at 1000g 10min
4)Washing with PBS
5)Centrifuge at 1000g 10min
6)step 5,6) two time retrun
7)Removed supernatant
8)RBC suspended in 50 ul of PBS
9)Add to e-tude 200ul treatment(Melittin)
10)1h, 37incubation
11)Centrifuge 1000g 10min
12)Move the supernatants(20ul) into 96 well plate
13)Absorbance measured at 415nm (ELISA)
14)100% Hemolysis – 0.1% Tritonx-100
   0% Hemolysis – PBS
           Control – Melittin

          
15)Calculated : (Peptide - PBS)/(Tritonx-100 – PBS) x 100

 

이렇게 입니다.

질문이 있습니다.

1번 : 만약 사람 혈액을 가지고 한다면  Sample 하나당 1ml 사용하면 될까요?

2번 : heparin(2heparin in 1ml blood) 을 사용 하는 분들도 계시고 사용안하시는 분들도 계시더라 구요

3번 : Centrifuge 사용시 온도를 10℃ 로 맞춰 사용하나요?

4번 : PBS 사용하여 희석을 해서 사용 하시는 분들도 계시던데요 희석을 얼마정도로 하는게 좋을까요?

5번 : Peptide처리 양이 제각각 이던데 제가 200ul 사용하려고 하는데 문제가 있을까요?

 

이상입니다. 처음 하는 실험이라 질문이 많았습니다.

연구원분들 부탁드립니다.

 

#hemolysis
 
#blood
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.18 14:29  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 1ml 정도 사용해도 됩니다.

2. 채혈 시 EDTA 또는 헤파린으로 항응고 처리하면 됩니다.

3. 10도 또는 저온으로 하면 됩니다.

4. PBS 희석은 어떤 단계를 얘기하나요?

washing할때는 500ul 정도 사용하면 됩니다.

5. 200ul 처리 할때 peptide 농도가 중요합니다.

올챙이z크핫z  |  02.18 16:05  

Speed님 답변 감사합니다.

 

1번 : 저의 뜻은 채혈 후 Centrifuge 돌린 다음 sup을 제거 후 PBS washing하고 pellet에 resuspension 할때  사용하는 PBS의 농도를 말하는 것입니다. 1xPBS 사용하나요? (상세히 적지 않음에 죄송합니다.)

2번 : pellet을 PBS로 희석해서 사용하는 것인지요? 아님 Pellet을 모두 1xPBS에 resuspension 하는 건가요?

3번 : peptide 처리시 (0, 2, 4, 8, 16, 32,.... ug/ml) 이런 양으로 처리을 할 생각입니다.

 

대왕개구리SPEED  |  02.18 16:13  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

농도 표시가 없으면 1X를 사용하면 됩니다.

생체시료는 보통 PBS를 사용하는 것이 pH, 삼투압에 적당합니다.

올챙이z크핫z  |  02.18 16:17  

답변 감사합니다.!

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