[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
물리적 거리두기 실천
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
LABox-과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 1047  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 western blot 관련하여 질문드립니다!
알zz94(과기인)  |  02.18 10:37
첨부파일 파일첨부: 1..jpg (249 KB)
이미지 첨부파일

western blot결과가 계속 안나와 도움요청드립니다.ㅠㅠ

1. membrane 0.2 pvdf - 사용전 methanol 담궜다 사용

2. gel - bio-rad 12% 사용

3. Buffer (loading, transfer) 구매해서 사용

4. gel loading : 80v 10min후 100v 30-40min

이 조건으로 하고있습니다. (cell extraction_RIPA Buffer+PI+PMSF)

문제는 트랜스퍼 후 저렇게 폰슈염색을 해보면 노란색 범위의 사이즈들이 확인이 안됩니다. gel을 염색해봐도 저 사이즈들에서 밴드가 확인이 안되요.

트랜스퍼 과정에서 문제가 있었나 하여,

30V, overnight 콜드룸 / 100V 1 h, ice / 100V 30 min, ice 로

확인해봤는데 다 결과가 저렇게 나오더라구요

gel 구매한 datasheet에도 transfer 조건은 100v 30min-1h으로 나와있습니다. 같은 membrane에서 노란색범위부분을 제외한 윗부분에선 ampk를 확인했을 땐 anti-body까지 붙혀서 밴드 확인이 가능하구요.

GAPDH, IL-6가 저 범위에 해당하는데 시그널 강한 GAPDH조차 확인이 안됩니다ㅠㅠ  팀장님은 잘모르셔서 문제점에서 계속 벗어난 이야기만 해서 디스커션도 불가능하고 너무 답답하고 스트레스받고... 답변 부탁드려요!

 

#웨스턴
 
#안티바디
 
#트렌스퍼
답변하기
검색광고 검색광고
[(주)필코리아] NEB(New England Bio labs)한국총판 필코리아에서 주문하세요!
NEB (New England Bio labs) 한국총판 필코리아입니다. 저렴하고 빠른 배송으로 고객의 연구비와 시간을 절약해드립니다. 전국 어디서나 주문하세요. T:02-2105-7020, F:02-2105-7025, mail: info@philekorea.co.kr
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.18 10:45  

sample을 어떤 방법으로 준비했나요?

marker lane에도 지저분하게 보입니다.

우선 gel을 염색해서 SDS-PAGE가 정상적으로 되는지 확인할 필요가 있을 것

같습니다.

 

알zz94  |  02.18 10:51  

upload_image

추가로 다른 사진도 첨부합니다.

RIPA Buffer+PI+PMSF 사용하구요, PBS워싱 후 60mm dish 기준 혼합한 buffer 100 ul씩 처리하여 모아준뒤 ice에서 10분 정도 방치하고 4도 센트리 이용하여 harvest 합니다. 

답변하기
할인행사 광고 검색광고
케이비티 케이비티
Stirrer, Dry Bath, Shaking Incubator, Thermo Shaker 등을 새롭게 런.. (6.31까지)
크로니텍 크로니텍
[로고스바이오]LUNA 셀카운터 시리즈 소모품 패키지 할인! (5.31까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
6/6  좌우
111,300105,800
178,700169,800
80,40076,400
25,80024,600
72,90069,300
441,000419,000
67,10063,800
175,600166,900
61,10058,100
184,000174,800
134,500127,800
214,400203,700
57,50054,700
80,90076,900
56,10053,300
51,40048,900
226,100214,800
47,20044,900
60,70057,700
49,40047,000
74,00070,300
278,400264,500
79,50075,600
274,200260,500
최근등록   더보기 >
HPLC 질문입니다   04.10
블라스트 서치 결과 score와 e-value 등 결과 보는 법좀 부탁드립니다.   04.10
mES cell gene engineering (electroporation transfe...   04.10
면역학실험 기초질문   04.10
agarose electrophoresis 할때 sample... 1x 2x 4x 질문있습...   04.09
miRNA qRT-PCR 질문   04.09
세포에 sample 처리하는 방식에 대해   04.09
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 사용하시는 분 계신가...   04.09
fluorescence spectrophotometer 중에 농도가 엄청 낮게도 측정 가능...   04.09
멀티 스프레이 개발 중입니다. 부유물(염?)이 생겨서 침전물처럼 가라 앉는데 다음 중 어떤...   04.09
(주)비아이코퍼레이션
투표진행
Q. 멀티 스프레이 개발 중입니다. 부유물(염?)이 생겨서 침전물처럼 가라 앉는데 다음 중 어떤 물질에서 부유물이 생성 되었다고 판단되시나요?
참여하기
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크