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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 관련하여 질문드립니다!
알zz94(과기인)  |  02.18 10:37
첨부파일 파일첨부: 1..jpg (249 KB)
이미지 첨부파일

western blot결과가 계속 안나와 도움요청드립니다.ㅠㅠ

1. membrane 0.2 pvdf - 사용전 methanol 담궜다 사용

2. gel - bio-rad 12% 사용

3. Buffer (loading, transfer) 구매해서 사용

4. gel loading : 80v 10min후 100v 30-40min

이 조건으로 하고있습니다. (cell extraction_RIPA Buffer+PI+PMSF)

문제는 트랜스퍼 후 저렇게 폰슈염색을 해보면 노란색 범위의 사이즈들이 확인이 안됩니다. gel을 염색해봐도 저 사이즈들에서 밴드가 확인이 안되요.

트랜스퍼 과정에서 문제가 있었나 하여,

30V, overnight 콜드룸 / 100V 1 h, ice / 100V 30 min, ice 로

확인해봤는데 다 결과가 저렇게 나오더라구요

gel 구매한 datasheet에도 transfer 조건은 100v 30min-1h으로 나와있습니다. 같은 membrane에서 노란색범위부분을 제외한 윗부분에선 ampk를 확인했을 땐 anti-body까지 붙혀서 밴드 확인이 가능하구요.

GAPDH, IL-6가 저 범위에 해당하는데 시그널 강한 GAPDH조차 확인이 안됩니다ㅠㅠ  팀장님은 잘모르셔서 문제점에서 계속 벗어난 이야기만 해서 디스커션도 불가능하고 너무 답답하고 스트레스받고... 답변 부탁드려요!

 

#웨스턴
 
#안티바디
 
#트렌스퍼
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대왕개구리SPEED  |  02.18 10:45  

sample을 어떤 방법으로 준비했나요?

marker lane에도 지저분하게 보입니다.

우선 gel을 염색해서 SDS-PAGE가 정상적으로 되는지 확인할 필요가 있을 것

같습니다.

 

알zz94  |  02.18 10:51  

upload_image

추가로 다른 사진도 첨부합니다.

RIPA Buffer+PI+PMSF 사용하구요, PBS워싱 후 60mm dish 기준 혼합한 buffer 100 ul씩 처리하여 모아준뒤 ice에서 10분 정도 방치하고 4도 센트리 이용하여 harvest 합니다. 

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