실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
western blot 관련하여 질문드립니다!
레벨1 zz94 (과기인)
western blot결과가 계속 안나와 도움요청드립니다.ㅠㅠ
1. membrane 0.2 pvdf - 사용전 methanol 담궜다 사용
2. gel - bio-rad 12% 사용
3. Buffer (loading, transfer) 구매해서 사용
4. gel loading : 80v 10min후 100v 30-40min
이 조건으로 하고있습니다. (cell extraction_RIPA Buffer+PI+PMSF)
문제는 트랜스퍼 후 저렇게 폰슈염색을 해보면 노란색 범위의 사이즈들이 확인이 안됩니다. gel을 염색해봐도 저 사이즈들에서 밴드가 확인이 안되요.
트랜스퍼 과정에서 문제가 있었나 하여,
30V, overnight 콜드룸 / 100V 1 h, ice / 100V 30 min, ice 로
확인해봤는데 다 결과가 저렇게 나오더라구요
gel 구매한 datasheet에도 transfer 조건은 100v 30min-1h으로 나와있습니다. 같은 membrane에서 노란색범위부분을 제외한 윗부분에선 ampk를 확인했을 땐 anti-body까지 붙혀서 밴드 확인이 가능하구요.
GAPDH, IL-6가 저 범위에 해당하는데 시그널 강한 GAPDH조차 확인이 안됩니다ㅠㅠ 팀장님은 잘모르셔서 문제점에서 계속 벗어난 이야기만 해서 디스커션도 불가능하고 너무 답답하고 스트레스받고... 답변 부탁드려요!
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