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 전체 > Cell Biology > Transfection
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질문 crispr cas9 도와주세요~
알훔냥(과기인)  |  02.17 18:12

Crispr cas9 관련 K/O 실험 진행중에 있습니다.

K/O하는 gene은 chromatin remodeling complex 관련 gene이구요.

K/O여부를 쉽게 확인하기 위해 GFP 및 flag taaging 된 Cripr cas9 vector를 업체통해 제작한 뒤 실험에 사용했습니다.

일단 cancer cell에 사용하기 전에 vector working 부터 확인 하기 위해 293TN에 transfection 한 뒤 GFP가 발현 되는 것을 확인 하였고, protein을 걷어서 flag가 뜨는 것을 확인 하였습니다. vector에 문제가 없다는 것으로 여기고..

cancer cell에 transfection을 진행 했습니다. 293TN보다는 transfection 효율이 떨어지는 했지만.. GFP posotive한 부분을 FACS로 sorting 한 뒤 single cell을 키워 확인하려 했는데... GFP가 cell을 키울수록 사라졌네요..;;;

GFP가 사라졌지만 혹시나 해서 single cell을 계속 키웠고.. 다행히 expansion이 잘되서  K/O level을  qRT-PCR 및 western을 통해 관련된 gene level이  k/o 되는 것을 확인 했습니다..

하지만.. GFP 발현은 안되고.. flag가 western에서 잡히질 않네요?

이럴수가 있을까요?

과연 이것을 K/O 되었다고 봐야 할지 정말 아리송 하네요...

고수님들 답변 부탁드려요

#crispr cas9
 
#transfection
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
흐음  |  02.17 19:11   

target gene을 pPCR이나 western blot으로 보셨으면 된거 아닌가요;;;

그리고 GFP 발현이 transient 하기 때문에 곧 사라집니다. 정상적인 것이고요. 

flag은 어디에 달린거에요? Cas9에 달리게 해놓은건가요...

 

 target gene 사라졌는데 KO여부를 궁금해하시면... 뭐라 답을 드려야 할지;;;

 

개구리bio  |  02.20 03:49  

GFP/FLAG이 Cas9에 달려있는것인가요? 내용상 이렇게 이해가 되는데요..

이 경우는 Cas9 vector가  셀 안으로 들어가서 Cas9이 발현을 했다는 것을 보여주려는 것이구요 

Cas9 vector가 genome에 integration이 되지 않으면 GFP/FLAG도 사라지겠죠..

정확한 것은 INDEL을 NGS (next generation sequencing)을 돌려서 확인하시면 됩니다. 이 gene/protein level을 확인해주었으니 NGS만 첨가 시키면 완벽한 Fig 하나가 나옵니다. 

HDR이 아니라 NHEJ로 INDEL 만들어서 KO시킨것으로 생각이 되는데요

이런 경우는 single clone으로 sorting 한 후에 clone 별로 어떤것이 가장 효과가 좋은지 확인해주는 것이 좋습니다. 

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