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 전체 > Cell Biology > Viability
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질문 3T3 MTT 3달째 실패중
알애리닝(일반인)  |  02.17 17:05

안녕하세요 cell mtt 때문에 3달째 골머리를 앓는중이라 처음으로 bric에 질문글을 올려봅니다.

cell을 배운지는 1년이 안됐는데 작년 여름 휴가 전까지 mtt도 잘나오고 문제가 없었는데 그 이후에 다시 cell을 풀어서 mtt를 하니 24well plate에서 떨어져 나가는 경향이 계속 보이고 있습니다. 사수분과 함께 진행시 문제되는 점이 없다고 하신걸로 보아 핸들링에서 뭔가 cell에게 영향이 가는지.. plate에서 아예 떨어져 나가니깐 control은 물론 cell viability도 측정하기 어렵습니다.upload_image

사진처럼 well의 윗부분에 구멍이 나버리는데 대체 왜그러는걸까요

영문을 모르겠어요

ㅠㅠ 제발 도와주세요...

#cell
 
#MTT
 
#3T3
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알BioMate  |  02.17 17:34  

MTT는 안해봐서 같은 경우인지 잘 모르겠지만 calcein AM/EthD-1 viability testing을 했을 때 reagent가 녹아있던 DMSO 때문에 HUVEC들이 떨어져나온 적이 있었어요.

DMSO등의 문제가 아니라면 플레이트에 세포부착시키는 코팅이  잘안된것일수도 있을것 같네요.

알훔냥  |  02.17 17:48  

cell을 seeding 하실때 well 표면에 잘 퍼져서 seeding이 되었나요?

cell이 한곳으로 몰려서 seeding 이 되면.. cell이 위로 증식이 되버려서...

cell에 drug을 처리한다더니 하게 되면 cell이 통채로 떨어져 나갈 수가 있어요...

 

대왕개구리SPEED  |  02.17 17:59  

동물 세포 증식 특성은 single layer growth입니다.

cell이 위로 자라는 2 layer로는 자라지 않습니다.

1. cell이 자란 후 떨어져 나가나요? 아니면 cell이 균등하게 자라지 않았나요?

2. plate는 어느 제품을 사용하나요?

3. MTT는 어떤 protocol로 하나요?

알애리닝  |  02.18 11:50  

seeding 후 셀이 잘 달라붙는 것이 있고 안붙어있는것들이 있어요. 이런 차이가 왜 나타나는지 도대체가 모르겠어요

media 석션하고 mtt 시약 500ul씩 분주 인큐베이터에서 2시간 대기 후 dmso 500ul씩 분주 후 96well palte에 trasfer합니다. 실험하는걸 사수가 봐주셔서 실험 방법 자체는 문제가 없는 것으로 확인됩니다.

제 생각에는 seeding시에 핸들링에서 문제가 있지 않나 싶어 진짜 천천히 파이펫팅도 해보고 각도도 바꿔봤는데도 소용이 없어요.

도와주세요 ㅠㅠ 실험때문에 자존감 떨어져요

알저기요  |  02.19 13:59  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

MTT는 formazan이라는 insoluble product로 변하게 되는데, 그 product의 색깔이 파란색입니다. MTT 넣고 2시간 반응 후에 plate reader로 읽을 때에는 insoluble한 formazan을 soluble하게 만들어주어야하기 때문에 DMSO를 처리한 것으로 보여집니다. 

우선은 실험한 24 well plate의 well 색깔이 매우 흐릿하고, well 바닥에 구멍이 나 있는 것이 보입니다. 

다음과 같습니다.

1. MTT 시약 넣고 인큐베이터에서 2시간 반응시켰을 때 파랗게 색깔이 변하나요?

 

2-1. 변한다면 어세이는 잘된 것입니다.

2-2. 변하지 않는다면, seeding한 세포수가 매우 작았거나, 혹은 세포 자체의 viability에 문제가 있을 것 같습니다.

 

3-1. seeding한 후에 한번, MTT 처리하기 전, 즉 media suction하기 전에 한번 현미경으로 세포를 관찰해보세요. 실험자가 직접 cell 상태가 어떻게 변해가는지를 확인해가는 것이 좋습니다.

3-2. 실험군에서는 뜬 cell도 있고 바닥에 attach된 cell도 있을 수 있습니다. 그러나 대조군은 거의 모든 cell이 바닥에 attach되어 있어야합니다. 일단 현미경을 통해서 눈으로 대조군과 실험군 간 차이를 확인해보세요. 

 

4. MTT assay는 관련 논문의 조건대로 수행할 수도 있고, 아니면 실험자가 직접 적정한 seeding cell number와 실험군의 처리 반응 시간, MTT incubation time 등의 조건을 예비실험으로 잡아보는 것도 좋을 것 같습니다.

 

5. 이것저것 조건별로 해볼 건 다해봤는데 안된다고 하면, 이번에는 주변 동료 연구자 중에 세포배양 잘하는 연구자 분의 세포를 좀 얻어서 MTT 어세이를 해보세요.

더잘하고싶다  |  02.20 23:36   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

ATCC에 MTT assay protocol 있으니 참고해보시길.. 사수분이 가르쳐준 것도 안되진 않겠지만 MTT assay가 제가 생각하고 다른 분들도 생각하는 그 시약이 맞다면 그런 실험 방법이 적어도 부착 세포에 대해서 '정석'적인 방법은 아닙니다.

 

세포가 24 well등에서 떨어지는 건, 여러가지 문제가 있는데, 코팅 문제도 종종 있고 해서.. 몇 번 해봐도 계속 반복되면 코팅을 좀 해주고 하면 나아집니다.. 단, 코팅에 사용하는 라미닌이나 폴리L라이신 등이 실험에 간섭이 없는 경우에만..

거꾸로가는생활  |  02.21 14:38   

3T3 Cell 24well에서 seeding  했을때 파이펫 핸드링으로 잘 떨어집니다. 경험상... 국내산 well을 사용하시면 자주 그런일이 있더라구요. 조금 좋은 저는... 에펜걸 사용합니다. 그 이후에 이슈가 없더라구요. 만약 국내산껄 사용해야한다면 콜라겐2정도로 바닥을 코팅해 보는 것도 좋을 듯하네여. 바닥코팅에 따라서 그런 이슈를 잡을 수 있습니다.

에고  |  02.21 19:12   

Promega에 MTS를 사용하세요..formazan이 water soluble해서 반응 후에 바로 흡광측정하시면 됩니다....formazan 이 떨어지건 말건 걱정할 필요가 없어요.

과학이 발전하면 실험 방법도 발전해야되는데.. 아직도 MTT쓰시는데가 많네요.

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