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질문 천연물 처치 후 RT-PCR 시 유전자증폭 확인 불가 현상
개구리당구왕빠킹(과기인)  |  02.15 20:35

안녕하세요. 천연물에 대해 다루는 연구원입니다.

보통 천연물 시료의 생물학적 스크리닝과 함께 동물세포에 처치하여 유전자의 발현 변화를 확인함으로써(RT-PCR) 타겟 방향을 결정한다거나 효능을 확인하곤 합니다. RT-PCR은 세포로부터 TRIzol을 이용하여 RNA를 확보한 후 oligo dT primer를 이용하여 cDNA를 합성한 후 수행합니다.

일반적으로 세포에 시료를 처치하였을 때, 세포가 죽거나 그렇지 않으면 특정한 유전자의 발현 변화가 나타나야 하는데, 아래 그림과 같이 몇몇 시료에서 모든 유전자의 발현이 나타나지 않는 현상이 발생합니다(housekeeping gene 포함). 이때 세포의 viability는 감소하지 않으며, LDH 또한 증가하지 않고, 세포 모양도 크게 변하지 않습니다.

upload_image

마우스, 랫, 휴먼 cell line, primary cell에서 모두 같은 현상이 확인되었으나, western blot 또는 ICC로 해당 protein을 확인하면 매우 잘 발현하고 있습니다.

혹시 이러한 현상이 나타나는 원인에 대해 알고 계신 연구자분들의 고견을 듣고 싶습니다. 감사합니다.

#RT-PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.15 22:27  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

viability가 유지되면 당연히 protein level은 잘 나옵니다. 

실제로 물질농도 의존적으로 이런 현상이 일어나는지를 먼저 확인해 봐야

할 것 같습니다.

물질 농도 ++이상 처리 시 시간 별 cell number, mRNA 농도를 확인하여

cell number가 정상적으로 증가하고 mRNA 농도가 사라진다면 어떤 mechanism

이 작용하여 mRNA half-time이 상당히 짧아졌다고 생각이 듭니다.

그러나 cont. cell 대비 ++이상 처리한 cell에서 cell 수가 증가하지 않고

mRNA 농도가 사라진다면 HK gene의 발현이 정지되었다고 생각됩니다.

이런경우 cell이 죽기전까지 protein level은 상당시간 유지됩니다.

전체적으로 추정하건데 cell이 살아있지 않은 상태이며 WB에서 protein이

잡히며 mRNA 합성은 정지된 경우일 수도 있습니다.

시료 처리 후 몇시간 후에 cell을 회수하는지 모르겠지만 배양 시간을 더 늘여서

cell morphology 및 viability를 측정해 보는 것도 필요할 것 같습니다.

경우에 따라서는 novel mechanism이 있을 수도 있지 않겠습니까?

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