실험 Q&A Microbiology > Bacteria
E.coli transformation 실패 원인...
레벨1 우으앙 (대학원생)
안녕하세요.
실험실에 미리 들어와서 간단한 일을 하고 있는 예비 대학원생입니다.
실험실에 업체에서 주문한 DNA가 있는데 plasmid 안에 들어있습니다. 이걸로 실험을 진행하게 되었는데 이 DNA의 양이 모자라 E.coli에 transformation하여 plasmid를 분리하여 양을 늘리려고 어제부터 두 번 실험을 했는데 결과가 안 나옵니다. pUC57 plasmid로 ampicillin 저항성 유전자를 가지고 있는 걸 확인하여 selection media를 이용하였고, 이전에 학부연구생 활동을 하면서 엄청 많이 해본 실험이라서 전혀 문제가 없을 것이라고 생각했는데 계속 해서 되지 않아 당황스럽습니다. 사수는 현재 휴가를 가서 없는 상태입니다. ㅠㅠ
Plasmid 형태로 있던 이 DNA 말고, 추가로 다른 종류의 plasmid로 digestion과 ligation을 한 후에 transformation한 것에서도 colony가 나오지 않아서 transformation에서 문제가 있는 것이 확실하다는 판단은 하였습니다. 어떤 부분에서 잘못된 것인지 짐작이 가는 부분이 있으시다면 말씀해주세요...
실험실에 들어온지 얼마되지 않아서 제가 만든 competent cell이 없는 상태라 다른 분의 것을 빌렸습니다.
Ampicillin은 50mg/1ml가 되도록 sodium ampicillin 가루를 dH2O에 녹여 1000X를 만들었고, LB 배지를 autoclave 후에 어느 정도 식었을 때 50ml에 50ul를 넣어 1X 농도로 하여 plate에 넣고 굳은 뒤에 호일로 덮어 냉장고에 하루 정도 보관했습니다.
-80℃ 냉동고에서 꺼낸 후에 ice에 넣어서 살짝 녹인 후 plasmid를 1ul 넣어주고 가볍게 섞어준 뒤 다시 얼음에 20분 동안 두었습니다.
미리 42℃로 데워둔 water bath에 90초 동안 tube를 넣어서 heat shock을 준 뒤에 다시 얼음에 옮기고 2분 동안 두었습니다.
1ml의 항생제가 없는 LB 배지를 넣고 40분 동안 shaking incubator에 넣어서 기르고 꺼낸 뒤에는 spin down을 하고 배지를 약간 제거하고 다시 피펫으로 섞어서 ampicillin이 들어있는 LB plate에 넣고 spreading을 하였습니다. 화염멸균 후에 적당히 식힌 후 배지 구석에 스프레더를 문질러 식힌 후 액체 배지에 닿게 했습니다.
그리고 37℃ incubator에서 12hr 배양했습니다.
1. Competent cell을 spin down 하고 배지를 약간 제거한 후 피펫으로 다시 섞을 때 세포가 뭉쳐있는듯한 느낌을 받았습니다. 이전에 실험할 때는 spin down 후에도 몇 번만 피펫팅하면 바로 섞이는 느낌을 받았었는데. 가끔 E.coli를 오래 둔 뒤에 피펫으로 섞으면 드는 듯한 느낌이 들어서 이상하다고 느꼈었습니다.
2. 이번 실험과 저번 실험에서 모두 colony가 하나도 관찰되지 않았었는데 저번 실험에서는 기계 사용법을 몰라서 37℃ heat shock이 아니라 미온수에서 진행을 했었습니다. 그런데 bric을 찾아보니 heat shock이 없더라도 transformation이 일어나기는 한다는 글을 보니 heat shock의 문제는 아닌 것 같다고 생각했습니다. 미온수도 영하의 온도의 세포에는 shock으로 작용할 수도 있고, 이번 실험에서는 heat shock을 제대로 줬지만 colony가 0개가 나왔기 때문이었습니다.
3. Ampicillin? 실험실 분들에게 물어보니 sodium ampicillin을 사용하는 것이 맞고 1000X의 비율은 메뉴얼에 있는대로 했습니다. 그런데 ampicillin은 세포 배양 시간을 늘려야 한다는 글도 있었는데 40분은 너무 짧은 것이 아니었는지
Colony의 수가 극단적으로 0개가 나와서 많이 당황스러운데 혹시 위의 과정에서 수정해야 하는 부분이 있는지, 비슷한 경험을 하셨다면 어떻게 해결했었는지 가르쳐주시면 감사하겠습니다. ㅠㅠ
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