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DNA fragmentation assay 질문입니다.
레벨1 ILU (대학생)
http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/DNAFRAG.html
DNA Fragmentation Assays for Apoptosis Protocol
Protocol I : Triton X-100 Lysis Buffer
In 96 flat-wells plate, incubate 4×106 target cells (40 wells of 105 per well) with desired concentration of effectors (105 target cells per well).
After incubation, collect the cell sample in 1.5 mL eppendorf tube, spin down, resuspend with 0.5 mL PBS in 1.5 mL eppendorf tubes, and add 55ul of lysis buffer for 20 min on ice (4℃).
Centrifuge the eppendorf tubes in cold at 12,000 g for 30 minutes.
Transfer the samples to new 1.5 mL eppendorf tubes and then extract the supernatant with 1:1 mixture of phenol:chloroform (gentle agitation for 5 min followed by centrifugation) and precipitate in two equivalence of cold ethanol and one-tenth equivalence of sodium acetate.
Spin down, decant, and resuspend the precipitates in 30μL of deionized water-RNase solution (0.4mL water + 5μL of RNase) and 5μL of loading buffer for 30 minutes at 37℃.
Also insert 2 μL of Hindi III marker (12μL of Stock IV) on the outer lanes.
Run the 1.2% gel at 5V for 5 min before increasing to 100V.
1. 1.5mL tube에 세포 샘플을 수집
2. 원심분리하여 상등액 제거
3. 1.5mL tube에 PBS 0.5mL로 재현탁
4. lysis buffer 55μL를 첨가한 후 4℃에서 20분 동안 배양
5. 1.5mL tube를 12,000g에서 30분 동안 원심분리
6. 샘플을 새로운 1.5mL tube로 옮긴 다음 phenol:chloroform 1:1 mixture로 상등액 추출 (원심분리 후 5분 동안 부드럽게 교반)
7. cold EtOH 2 equivalence과 sodium acetate 1/10 equivalence로 침전
8. Deionized Water-RNase 용액(D.W 0.4mL + RNase 5μL) 30μL를 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 원심분리
9. 새로운 1.5mL tube로 옮긴 다음 loading buffer 5μL를 첨가한 후 재현탁
10. outer lane에 Hindi III marker(Stock IV 12μL) 2μL를 삽입
11. 1.2% gel을 5V에서 5분간 작동하고 100V로 증가
Protocol II : SDS Lysis Buffer
배양된 세포에 SDS lysis buffer 첨가(Protocol I에서와 같이 준비).
Stock I : Triton X-100 Lysis Buffer
0.5M EDTA 40mL, 1M Tris-Cl buffer (pH 8.0) 5mL, 100% Triton X-100 5mL, H2O 50mL
Stock II : SDS Lysis Buffer
Stock III : 1.2% Agarose Gel
Prepare a stock of 2 liter of 1X TAE (i.e., 2 liter + 40ml of 5X TAE).
Add 2.4g of agarose powder (1.2% agarose) to 200mL of 1X TAE solution and microwave for 4 min at high power.
Then cool the gel to 50℃ and add 25μL of ethium bromide before pouring it into the gel plate.
Insert comb and let the gel polymerized.
1. 1X TAE (즉, 2L + 5X TAE 40mL) 2L의 stock 준비
2. 1X TAE solution 200mL에 agarose powder(1.2% agarose) 2.4g 첨가
3. 고출력 상태에서 전자레인지로 4분 동안 돌리기
4. gel을 50℃로 식힌 후 ethium bromide 25μL를 첨가
5. gel plate에 붓기
6. comb을 넣고 젤을 중합
Stock IV : Hindi III Marker (50Kb lamda DNA)
Hindi III Marker 4μL, Deionized Water 16μL, Loading Buffer 4μL
이렇게 protocol이 나왔습니다..
protocol 중에서 궁금한 게 몇 가지 있는데
1.
PBS로 현탁한 후 원심분리 후 상등액을 제거한 후 lysis buffer 첨가로 진행되는 게 맞나요??
2.
6번에서 샘플이 상등액인지 pellet인지 알 수 있을까요??
제 생각엔 상등액 같은데..
phenol:chloroform 첨가가 다른 protocol에서는 동량 넣으라 해서..
3.
EtOH과 sodium acetate로 침전시킨 후
상등액을 제거한 후 말려준 다음 RNase 첨가가 맞는건가요??
4.
TAE buffer와 ethium bromide가 아닌
TBE buffer와 Redsafe로 시약을 변경해도 될까요??
질문이 많아 죄송합니다..
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