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 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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질문 qPCR threshold 질문입니다.
알신망고(대학원생)  |  02.11 22:29
target gene이 많아 96well plate에 한번에 실험을 진행하기 어려운 상황입니다.
따라서 각각 샘플의 target gene과 house keeping gene만 넣어 각각의 threshold를 잡아 Ct값을 구해도 괜찮을까요?

예로 모든 샘플값의 threshold를 잡으면 auto 시 RFU 값 2000의 threshold와 각 Ct값이 나옵니다. 하지만 한 샘플의 taget gene 1개(2반복) house keeping gen 1개(2반복) 만 넣어 threshold값을 잡으면 auto 시 1700 RFU 가 나오며 이때 taget gene과 house keeping gene의 ct값을 구한 뒤 이런식으로 구한 다른 target gene 들과 ddCt법을 통한 상대정량을 해도 괜찮을까요?아니면 모든 샘플의 threshold 값을 일정하게 맞춰주어야 할까요?

정리하자면 RT-qPCR을 통한 상대정량 시 96well을 넘어가는 실험에서 threshold 값을 어떻게 설정하는게 좋을까요?
1. 각각의 샘플에 대해 1개의 target gene과 house keeping만 넣어 각각 다른 auto threshold 값을 부여하여 상대정량하여야 할지?
2. 모든 샘플의 threshold 값을 통일하여 Ct 값을 읽어야할지?
궁금합니다.
#threshold
 
#qpcr
 
#ct
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리느림보  |  02.13 14:56  

샘플이나 target gene의 수가 많아지면 당연히 plate를 여러개로 나눠야 해서 실험이 복잡해지죠. 중요한 것은 reference gene (house-keeping)과의 차이 (dCt)이기 때문에, plate 마다 auto- 또는 수동으로 설정한 threshold를 적용하면 됩니다. 결과적으로 plate마다 threashold가 다 달라집니다. 또 그렇기 때문에 reference gene을 매 plate마다 포함시켜야 겠죠. 상대정량에서 중요한 것은 dCt값이기 때문입니다. 

 

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