추출가능합니다.
isolation protocol이 어떻게 되나요?
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레벨2
카제카게
(대학원생)
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20.02.10 22:48
SPEED 님께,
protocol.
실험에 사용된 bacteria -> gram negative
1. 고체배지에서 자란 bacateria를 긁어서 50ml 튜브에 넣고 액체질소에 급속냉각.
2. Trizol을 첨가하여 적절히 vortexing. 3min 진행, 3min 휴식 x2회 반복
3. centrifuge at x12,000g, 4도씨, 10min
4. 500ul을 덜어서, 새 e-tube에 옮기고, isopropanol 을 동량 첨가하여 RT에서 15min.
5. centrifuge x12000g 4도씨, 15min
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6. 상등액은 모두 버리고, pellet을 RLT (+bme) 를 첨가하여 풀어주고, 70% EtOH를 첨가하고 분홍색 column에 통과시킨다. (이후부터, Qiagen RNeasy protocol)
이렇게 진행하였습니다.
5번까지는 어디에 나와있는 방법인가요?
5번까지 진행하면 ppt에 RNA가 거의 없습니다.
Qiagen 방법을 사용하려면 처음부터 사용하는 것이 좋습니다.
5번까지는 qiagen 방법이 아닌 것 같고 6번 이후는 qiagen 방법을 사용한것
같습니다.
TRIZOL을 사용하면 chloroform으로 1회 추출을 추가 진행하는 것이 좋고
4번에서 5M NaCl, 3M NaOAc, 3M LiCl 중 하나를 상등액의 1/10 부피를 넣고
iPA와 잘 혼합 후 원심분리하면 RNA ppt가 tube 바닥에 보입니다.
ppt를 70% EtOH로 1회 washing 후 dry하면 column 사용하지 않고 RNA를
얻을 수 있습니다.
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레벨2
카제카게
(대학원생)
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20.02.11 14:44
SPEED님께,
말씀대로, 4번과정에서
상등액 450ul + 3M NaOAc 50ul 진행하였습니다.
하얀 밴드/실 같은것이 보이는것을 확인하였고, gently inverting 이후
Isopropanol 500ul을 첨가하여 RT에서 침전시킨 뒤,
5번과정을 거치고,
70% EtOH을 이용하여, wash 를 진행하였고,
elution 40ul을 이용하였습니다.
nanodrop결과
8333ng/ul,
260/280: 2.00,
260/230:2.00
으로 준수한 결과가 나왔습니다만, 전기영동결과가 아주 형편없습니다.
제 생각에는, iPA와 salt를 이용한 침전과정에서 문제가 있었지 않았나 생각이 듭니다.
혹은, 액체질소를 이용하면서 문제가 있었을것 같다는 생각이들기도 합니다.
iPA 침전은 별 문제 없는 것 같습니다.
bacteria는 tube에 넣고 액체질소에서 냉동할 필요는 없습니다.
1. bacteria 를 tube에 넣고 TE buffer로 현탁 후 원심분리해서 cell을 down.
2. ppt에 TE buffer를 넣고 cell을 현탁 후 TRIZOL을 넣고 10초 vorteix X 5회
3. 원심 분리 후 상등액 회수
4. chroloform 1회 추출
5. 상등액 + salt + iPA를 잘혼합 후 원심분리
6. ppt 70% EtOH washing
7. ppt dry 후 멸균수 용해
8. 전기영동 확인
spin column을 사용하지 않아도 RNA 분리는 잘됩니다.
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레벨2
카제카게
(대학원생)
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20.02.11 17:54
SPEED님께,
선생님께서 알려주신 방법대로 진행해보았습니다.
(액체질소 사용하지 않고, 진행하였습니다.)
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1. bacteria 를 tube에 넣고 TE buffer로 현탁 후 원심분리해서 cell을 down.
2. ppt에 TE buffer를 넣고 cell을 현탁 후 TRIZOL을 넣고 10초 vorteix X 5회
->Trizol 1ml 첨가
->10초 진행, 5초 ice x5회 진행함.
3. 원심 분리 후 상등액 회수
-> 세포벽성분?으로 보이는 것들이 아래로 가라앉음.
-> 1ml 회수
4. chroloform 1회 추출
-> 'chloroform 1회추출'의 의미를 잘 모르겠어서,
-> Trizol 1ml 당 chloroform 200ul을 첨가하여 vortexing 15s 진행 후, centri
5. 상등액 + salt + iPA를 잘혼합 후 원심분리
-> 상등액 500ul에 3M NaOAc 56ul 먼저 첨가 -> 실같은 것 보임.
-> iPA 560ul 첨가 -> gently inverting, RT 15min
6. ppt 70% EtOH washing
7. ppt dry 후 멸균수 용해
8. 전기영동 확인
5543ng/ul, -> 10ul loading에 사용(5ug RNA 전기영동)
260:280 -> 2.00
260:230 -> 1.85
전부 분해된 RNA인지, digested DNA인지 구별이 안갈정도의 진한 밴드는 여전히 나옵니다.
하지만, 23S 16S의 band가 살짝 보여서 다른 결과보다는 더 좋은것 같습니다.
원래 이렇게 나타나는게 맞는지 궁금하네요...
사진처럼 나오지만 small RNA가 좀더 적게 나오고 23, 16S가 좀더 나오는 pattern
으로 분리됩니다.
우선 cell 양을 정확히 알수 없어 적정양인지 모르겠네요.
microtube에서 추출하는 것을 기준으로 설명하면
cell washing 후 spin down 시 tube 사진이 있으면 한번 보여주세요.
cell pellet의 양을 한번 확인해보고 싶네요.
cell을 TE로 washing 후 TE 400ul를 넣고 vortex후 아래 단계로 진행 해 보세요.
1. TRIZOL 0.4ml : TE 0.4ml를 혼합 후 교반 lysis하세요.
교반의 앞의 조건과 동일
2. (추가) 60도, 10분 incubation 후 ice 5분
3. 원심분리는 최소 13K, 15분, 4도 의 조건으로 해 보세요.
4. 원심분리 후 상등액을 회수 후 동량의 chloroform을 혼합한 후
inverting 10회 후 최소 13K, 15분, 4도 의 조건으로 원심분리.
TRIZOL 후 chloroform을 처리하는 것은 phenol이 수용액 층에 소량 녹아 들어
가기 때문에 제거하기 위해서 chloroform을 처리합니다.
5. 원심분리 후 수용액 회수 후 salt, 동량의 iPA 혼합 및 inverting 10회.
6. -20도 20분 또는 -80도 10분 후 13K, 15분, 4도 의 조건으로 원심분리.
7. 70% EtOH로 1회 washing.
8. RNA ppt 건조 및 재용해
9. 전기영동 확인
plate가 균이 자란지 얼마나 되었나요?
이 방법으로도 비슷하게 나오면 균이 fresh하지 않아서 그럴수도 있고
fresh한 plate에서 다시 분리해 보세요.
균이 fresh하면 아래와 같이 나옵니다.
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레벨2
카제카게
(대학원생)
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20.02.12 12:59
SPEED 님께,
말씀대로, 진행해보았습니다.
harvest를 진행했을 당시의 cell 양입니다.
다음은, 앞전에 말씀했던 내용의 protocol을 토대로 RNA를 추출한 결과이며, 전부 분해된 것 처럼 보이는 것 같습니다.
streaking 진행된지 약 10일이 걸렸습니다.
어떤 효과가 나타나기까지 기다리다보니, 오래배양해둔 bacteria sample이라서 이렇게 전부 부서진 RNA가 나타난 것 같습니다.
신선한상태에서 다시 진행해보도록 해볼께요.
SPEED님께서, 저를 도와줄 의무는 없지만, 친절히 답변해주시고 알려주셔서 정말 감사합니다.
균체량은 사진으로 봐서는 상당히많은 것 같습니다만 원심분리 후 상등액을
제거하여 cell ppt만 보면 정확히 알수 있는데 buffer와 혼합되어 있어
정확히 판단 할수가 없네요..
10일 정도면 조금 시간이 경과된 것 같습니다만 그래도 RNA 분리가 잘 안될
정도는 아닙니다.
fresh한 plate나 액체배양 균을 가지고 우선 RNA 분리가 잘되는지 확인을
먼저 해보세요.
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레벨2
카제카게
(대학원생)
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20.02.19 15:21
SPEED님께,
샘플을 준비하느라 시간이 소요되었습니다.
biofilm이 너무 많은것 같아, wash과정을 2번 거쳤는데, 제대로 추출이 되었습니다.
밑에 small RNA 또는 5S rRNA로 추청되는 band가 너무 많은데, 품질은 괜찮을련지...궁금하네요.
(260/280과 260/230 ratio가 모두 2.00이상 나와서 다행입니다.)
(3번째 RNA는 무시하셔도 됩니다.)
잘 추출되었습니다.
small RNA는 신경안써도 되고 가장 추출 잘된것을 100으로 봤을 때 95이상은
되는 것 같습니다.
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레벨2
카제카게
(대학원생)
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20.02.19 17:22
SPEED님!! 도와주셔서 감사합니다.