1. peptide와 target protein의 결합은 가역적인가요?
2. peptide와 protein을 먼저 반응 시킨 후 cell에 처리하나요?
3. peptide와 protein의 반응 몰 비율은 어떻게 되나요?
4. peptide 단독으로는 cell의 viability 또는 cell의 protein에 영향을 미치나요?
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레벨5
클레엉
(대학원생)
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20.02.05 16:08
1. peptide와 target protein의 결합은 가역적인가요?
-> 그 부분은 저희가 확인을 하지는 못했스빈다.
2. peptide와 protein을 먼저 반응 시킨 후 cell에 처리하나요?
-> 네, 10분간 반응시킨 후 처리하고 있습니다.
3. peptide와 protein의 반응 몰 비율은 어떻게 되나요?
-> 1:0.1~1:10까지 비율로 처리하고 있습니다.
4. peptide 단독으로는 cell의 viability 또는 cell의 protein에 영향을 미치나요?
-> 영향을 미치지 않습니다.
1. peptide와 protein의 몰 비율 [1 : 1이하]에서 100% 단백질에 peptide가
결합하는지 또는 free-protein이 없는지 확인해 보세요.
2. target protein의 active site에 peptide가 결합하는지 확인해 보세요.
3. peptide와 target protein의 결합에 10분이면 충분한지 확인해 보세요.
생각에는 1번, 3번을 정확히 확인해 보면 좋을 듯 합니다.
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레벨5
클레엉
(대학원생)
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20.02.05 16:42
1. peptide와 protein의 몰 비율 [1 : 1이하]에서 100% 단백질에 peptide가
결합하는지 또는 free-protein이 없는지 확인해 보세요.
-> 네 이부분 확인해보겠습니다.
2. target protein의 active site에 peptide가 결합하는지 확인해 보세요.
-> 이것은 결합하는 것으로 확인이 되었습니다.
3. peptide와 target protein의 결합에 10분이면 충분한지 확인해 보세요.
생각에는 1번, 3번을 정확히 확인해 보면 좋을 듯 합니다.
-> 3번 역시 확인해보도록 하겠습니다. 인큐베이션 시간을 더 길게 하는 방안을 고려해보겠습니다.
Peptide 가 같은 batch 에서 온 것으로 실험하고 있나요 ?
다른 batch 라면, 보통 같이 오는 mass spec profile 을 참고하여 순도를 확인해보시면 좋겠습니다.
또 peptide 합성시에 TFA 라는 salt 를 이용하는데, 이게 영향을 주지는 않는지요? desalting column 등으로 peptide 에 포함된 salt 를 컨트롤 해 주는 것도 좋겠습니다
추가적으로, 반응물 (단백질과 peptide) 의 농도 또한 생성물 (복합체) 형성에 아주 중요합니다.
Kd value 가 특출나게 좋은편이 아니라면, 1:1 로 섞는다고 해서 무조건 1:1로 결합하고 있지 않을 가능성도 있습니다.
이 부분을 Kd value 계산하는 수식으로 확인해보심이 좋겠네요
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레벨5
클레엉
(대학원생)
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20.02.10 10:33
Peptide 가 같은 batch 에서 온 것으로 실험하고 있나요 ?
-> 예 그렇습니다.
다른 batch 라면, 보통 같이 오는 mass spec profile 을 참고하여 순도를 확인해보시면 좋겠습니다.
또 peptide 합성시에 TFA 라는 salt 를 이용하는데, 이게 영향을 주지는 않는지요? desalting column 등으로 peptide 에 포함된 salt 를 컨트롤 해 주는 것도 좋겠습니다
->연구실에 PD-10 column 이 있습니다. 이 칼럼으로 컨트롤이 가능할지요? 다만 peptide 가 DMSO 에 녹는데, 여기 녹여진 펩타이드도 가능한 부분인지 궁금합니다.
Kd Value 부분에 대하여: 추가적으로 궁금한 부분인데요, 1:1 이 아니라면 펩타이드를 많이 때려넣으면(?) 더 인히비션이 되야하는거 아닌가요?ㅜㅜ 때로는 인히비션은 커녕 오히려 증가할때도 있고, 오히려 적게 넣었을 때 인히비션 되는게 보일 떄도 있어서 읭...? 스럽습니다 ㅠㅠ 독성이 있는 펩타이드는 아니구요ㅠ