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IgG 같은데요
IP한 Ab와 detection Ab가 모두 같은 origin이죠?
그리고 IP 하실 때는 컨트롤을 잘 넣으셔야 합니다.
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hunnnnn
(비회원)
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20.01.31 09:38
넵 IP Ab와 IB Ab 모두 Rabbit 으로 같습니다.
그리고..컨트롤을 잘 넣어야 한다는게 어떠 의미일까요?ㅠㅠ 전혀 감이 안와서요....어떤 컨트롤을 넣어야하는건지 알려주시면 감사하겠습니다.
그리고 저 밴드가 IP땡길 때 사용한 IgG 같다는 것인가요?
IgG 사이즈는 150kda 정도 되는 걸로 아는데.. 저 사이즈에서 잡힐수가 있나요?
Non-reducing condition에서는 150이 맞겠지만, reducing condition에서는 당연히 heavy, light chain으로 따로 잡히며 55, 25 정도로 나옵니다.
샘플이 각 3개 lane인데 각기 다른 샘플인가요? 아님 A: -++, B: ++-와 같은 조건으로 transfection 한건가요? 컨트롤이라는건 저 방식으로 트팩하라는 것이고, 둘 다 endogenous를 잡은거면 IgG control이 있어야 합니다.
인풋은 양쪽 단백질을 다 보여줘야 하구요.
아무튼 원하는 밴드는 못 보셨으니 해당 실험은 다시 하셔야 합니다.
윗 분께서 잘 답해주셨는데...
말씀하신 저 band는 IgG입니다. Immunoglobulin은 heavy chain 2분자와 light chain 2분자가 각각 45~50 / 25~30 정도의 분자량을 가집니다. 이들이 세포 내에서는 결합을 통해 subunit끼리 뭉쳐있는데, 실험을 위해서 샘플을 끓이게 되면 이 결합이 다 끊어지면서 각 subunit으로 분리가 됩니다. 그래서 저렇게 나오는 겁니다..
그리고 interaction을 보신다고 했는데 protein-protein interaction을 보실려면 우선 두 단백질이 direct binding인지 indirect binding인지를 확인해보시는 것도 좋을 것 같습니다. 두 단백질만의 상호결합이라면 IP를 해도 충분히 결과를 볼 수 있지만 만약 indirect binding의 경우 IP를 하고 WB를 했을 때 잘 안 보일 수도 있습니다.
이 경우, GST fusion protein같은 것으로 in vitro binding 실험을 통해 확인해 볼 수도 있고, Farwestern으로 확인할 수도 있습니다.
혹은 윗분 말씀처럼 transfection을 해서 단백질 과발현한 이후에 tagging된 것으로 끌어내리고 binding protein antibody로 detection해 볼수도 있습니다. 그러나 이 경우 단백질의 발현도나 분리했을 때의 yield에 따라 binding protein이 잘 detection되지 않을 수도 있다는 것은 고려하셔야 하구요...
bead only (IP 동일 vol.) line을 걸어서 비교해 보시면 명확한 해답을 얻으실 수 있을 것 같습니다.