실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Extraction/Isolation
SDS-PAGE를 했는데 결과가 당혹스럽습니다.
레벨1 참치뱃살 (대학생)
SDS PAGE를 진행하기 위해 임의로 손에서 얻은 균을 LB agar 배지에 배양 후, 자란 균들 중 colony 하나를 취해 액체 LB 배지에 배양하여 단백질 추출을 진행하였습니다.
균의 단백질을 추출해본 결과 sample1에서는 48μg/ml이 나왔고 sample2 에서는 40μg/ml이 나왔습니다. sample1은 sonication을 진행하였고 sample2는 vortexing만 진행하였습니다. 이 과정에서 sonication을 이미 사용 중인 분이 계셔서 최소 30분 이상 RIPA buffer를 넣은 상태로 지체되었습니다.
균의 단백질 추출의 과정은 protocol을 따라 만들었으며, RIPA buffer의 양을 조금 많이 넣기는 했습니다. (이 이유로 단백질의 양이 적을 수도 있다고 하였습니다.)
적은 양이 검출되었지만 전기영동을 해보아서 나올지 안 나올지와 실험 숙련도의 향상을 위해 진행을 해보았습니다.
SDS-PAGE 또한 기본 protocol을 따라 진행하였기 때문에 잘못된 시약을 사용하는 일은 없었습니다.
electrophoresis 시 tank buffer를 재사용하기도 하였고(WB시는 문제가 없는데 SDS-PAGE에서도 문제가 없는지는 정확히 확인은 못해보았습니다.) 전기영동시 평소 45mA(80V)로 진행 하였으나 그 날 여러 상황에 의해서 전기영동시 300V로 진행하게 되었습니다.
Polyacrylamide gel 과 gel에 분주하는 과정(옆으로 넘치거나 하는 일)에서는 숙련자의 도움을 받았기 때문에 문제가 없었습니다.
gel은 만들어 둔지 시간은 좀 지났었으나 4℃에서 tank buffer를 채워서 잘 보관중이였습니다.
sample들은 loading dye와 섞어 최종 볼륨이 60μl가 되게 넣었습니다.( 구멍에 최대한 넣기 위해 최대 볼륨을 넣었습니다.)
겔 사진이 없긴 한데 그림으로 아래 첨부하였고 Gel에 좌측부터 3곳에만 sample1, sample2, marker를 넣고 electrophoresis를 진행 한 후 coomassie blue로 염색을 overnight 한 후 오전에 탈색을 진행한 뒤 gel을 관찰해 본 결과 첨부한 그림과 같이 marker는 아주 잘 나왔고 모든 레일에서 2줄의 연한 band가 검출되었습니다.
sample이 검출이 연하게 되거나 안 나오면 ‘아 단백질의 양이 적구나’ 라고 생각할 수 있었으나 모든 레일에서 같은 band가 복사 붙여넣기 한 것처럼 같은 모양을 취하고 있었습니다.
이로써 이제 저희의 궁금증이 생기게 되었는데요. 도대체 왜 어떠한 이유로 같은 band가 모든 레일에서 검출이 되게 된 것일까요. 같은 조건에서 재 실험을 해보려고 하였으나 이유를 알고 진행해 보고 싶어 이렇게 질문을 올리게 되었습니다. 어디가 문제일지 몰라서 가능한 다 적으려다보니 글이 길어지게 되었습니다.
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