실험 Q&A Immunology > ELISA
detection이 안됩니다
레벨4 juyu21 (대학원생)
현재 western blot 결과가 나오지 않아 고생하고 있는 대학원생 입니다
원래 생물학이 주전공이 아니라 더 힘든것 같습니다
protein은 300 ug/lane 씩 로딩하고 있습니다
이 양이 혹시 많은건가요?? 브릭에 보면 거의 100 ug미만으로 하시던데
양을 적게해야되는 이유가 있는건가요?
1st Ab는 1:1000으로 희석해 4도씨에서 overnight
2nd Ab는 1:1000으로 희석해 실온에서 1 h
PVDF membrane을 사용합니다
문제는 detection인데요
우선, 저희 실험실은 GE사의 ECL, agfa의 x-ray film, ilford사의 developer와 fixer을 사용합니다
카세트에 멤브레인을 랩으로 씌운 후 암실에서 보면
늘 b-actin만 Ab쪽만 선명하게 빛이 보입니다(밴드 모양이랑 동일)
그러나 x-ray film을 붙여서 detection하면 나오지 않습니다.
최소 1분-24 시간 까지 해봤습니다
그런데 필름에는 전혀 밴드 모양이 잡히지 않습니다
(x-ray film의 원리는 빛에 의해 타는 것이라고 들었는데 아닌가요?)
membrane에는 b-actin쪽만 검게 탄 밴드모양이 남습니다
결과가 나오지 않아 너무 답답합니다.
고수님들 도와주세요
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