실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
사용하는 insert 말단에 A가 붙어있다면 ligation 조건을 한번 검토해 보세요.
ligation 후 전기영동으로 확인해 보면 ligation이 잘되는지 확인 가능합니다.
T vector는 Taq DNA pol로 증폭한 DNA 만 ligation 됩니다.
Pfu DNA pol 같은 proofreading 기능이 있는 polymerase가 증폭한 DNA는 ligation되지 못합니다. 그래서 Pfu DNA pol로 증폭한 다음 정제하고 dNTP를 넣고 Taq DNA pol을 넣어서 72도시에서 30분 반응시키면 증폭된 DNA 말단에 A가 붙어서 T vector에 ligatin 됩니다.
혹시 이 과정을 다 거쳤는데도 cloning이 안되면 T vector를 의심해야 합니다.
클로닝할때 insert와 T vector를 ligation하는 것과, T vector만 ligation 한 것을 transformation 해 보세요.
만일 두 경우 모두 colony가 유사한 숫자만큼 나오면 T vector가 잘못된 것입니다. T vectro는 self-ligation이 되지 않아야 정상이거든요.