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질문 urine 을 이용한 가수분해 실험 질문입니다.!
올챙이vgb539(대학원생)  |  01.20 16:54

약물을 먹인 rat, mouse urine sample 에 B-Glucuronidase를 이용하여서 , 가수분해 실험을 하여  약물의 재순환을 확인하고자 합니다.

이때 b-glucuronidase 의 buffer 용액으로 100mM ammonium acetate 를 만들어 PH5로 맞추고 protocol 을 짜보았는데 처음이라 이렇게 하는것이 맞는건지 여쭈어볼려고 합니다. 

b-glucuronidase 파우더형태를 버퍼 용액으로 스탁솔루션을 만든뒤 ph를 5로 맞추는건지 가 궁금합니다...

#urine
 
#protocol
 
#buffer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.20 17:44  

bovine liver 유래 beta-glucosidase 최적 assay buffer의 pH는 5.0, E.coli 유래 효소는

pH 6.8입니다.

buffer를 먼저 만든 후 효소를 원하는 농도로 녹이면 됩니다.

 

올챙이vgb539  |  01.20 19:21  

그렇다면 urine 샘플과 buffer 용액으로 만든 b-glucuronide 용액을 SPIKE 할시에는 어떤 비율로 해야되는건가요??

논문이나 유사한 자료를 참고 하였을경우 B-GLUCURONIDE 용액 같은경우 1000Unit 으로 보통 하였는데 이게 urine 샘플과의 비율 조절은.... 나온것을 못보아서 한번 여쭈어봅니다.

대왕개구리SPEED  |  01.20 19:34  
위 답변에서 beta-glucosidase는 beta-glucuronidase입니다.
 
어떠 방법으로 발색할 예정인가요?
 
효소량은 250U ~ 500U / ml정도로 사용하면 됩니다.
 
 
 
 
올챙이vgb539  |  01.21 10:15  

예 beta-glucuronidase (helix pomatia)의 lyophlized powder 형태를 100mM ammonium acetate 로 활성pH인 5까지 만들어준뒤 약물을 투여하고 채취한 urine sample 1ml 에다가 beta-glucuronidase 를 첨가하고 is를 첨가하고 37도에서 incubate 시킨뒤 분석을 할 예정입니다.

제가 protocol 을 짠결과 1000 unit 으로 할예정인데 beta-glucuronidase powder 형태가 300,000 unit/g 가 100KU 들어있는것을 구입을 하였습니다.

그래서 buffer 용액으로 몇 g을 녹여야 하며 urine sample 과 spike 되는 비율이 혼동되어서 여쭤봤습니다. ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  01.21 10:33  

1000U이라는 것이 1000U/ml이라고 생각하고 설명하면..

제품 g 당 300KU이며 100KU가 들어 있다면 약 330mg정도 됩니다.

300U/mg이기 때문에 1KU/ml을 만들려면 ml에 3.33mg을 넣으면 1KU이 됩니다.

그리고 urine sample과 spike되는 비율이라는 것이 무슨 뜻인가요?

urine이 sample 아닌가요?

 

올챙이vgb539  |  01.21 10:38  

예! 맞습니다. urine이 sample 입니다.

거기에 이제 가수분해 시키기위해서 beta-glucuronidase 를 넣는건데 

urine sample 에다가 beta-glucuronidase 를 첨가할시 

urine 몇 ul 에 glucuronidase 는 몇 ul 를 넣을지 그것도 혹시 정해진 비율이 있는건지 싶어서 여쭈어보았습니다.!

대왕개구리SPEED  |  01.21 10:43  

반응액 중의 효소량은 예비 실험을 통해 정하면 됩니다.

urine + 효소를 반응하여 product를 detection할 때 효소량과 반응시간을 조정

하며 product양이 더 이상 증가하지 않는 조건을 찾아 37도 고정 조건에서의

효소량과 반응시간을 정할 수 있습니다. 

 

올챙이vgb539  |  01.21 11:19  

혹시 그러면 powder 형태로 b-glucuronidase 를 buffer 용액으로 

1ku/ml 로 만들고 urine 에 넣으면 유린의 ph로 인해서 B-GLUCURONIDASE의 PH 5가 변하지는 않는가요..? 활성 ph가 5인데 유린에 넣을시 ph가 변하여서 활성범위 ph가 안되는경우는 어떻게 하나요..? buffer용액을 더 추가로 넣어서 보통 맞추는건가요??

대왕개구리SPEED  |  01.21 12:07  

효소반응액의 구성은 효소 + 버퍼 + sample(기질)입니다.

stock buffer를 사용하여 효소반응액의 pH를 조정합니다.

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