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질문 Sandwich ELISA 단백질 농도정량 Variation 문제
알아카시아꿀(대학원생)  |  01.19 02:19

안녕하세요. ELISA assay때문에 전전긍긍하는 석사과정 대학원생입니다.

저는 Sandwich ELISA로 동물세포에서 과발현시킨 단백질발현양을 정량하려고 하고 있습니다.  sample은 secretion된 단백질이기에 cell-free supernatant입니다. 

과발현 생산량이 목적이다보니 그 농도가 ng/ml~ug/ml 단위까지 가는것같습니다.

저는 ELISA kit를 따로사용하지않고 Inhouse ELISA로 항체, 스탠다드, 버퍼 모두 각각 구입하여 실험실에서 만든 프로토콜로 실험을 진행합니다.

 

Standard도 잘 잡히는듯 보이고 모두 duplication으로 진행하는데 sample, standard모두  CV값 차이도 크게 없습니다.

다만, 똑같은 스탠다드와 capture, detection antibody를 사용하고 그 외 Strepavidin-HRP, TMB 모두 일정히 같은걸로 사용하는데

O.D값이 할때마다 조금 신경쓰일만큼 다르게 나옵니다. 이런건 크게 고려하지 않아도되는건가요?

 

예를 들면, 스탠다드를 serial dilution을 1/2씩 했을 때,  O.D값이 3.0->2.2->1.1->0.5->.. 이런식으로 오늘 나왔다고 하면 다음날 똑같은 엘라이자를 진행했을때는 

2.4-> 1.8-> 1.0->.. 이런식으로 꽤나? 차이가 납니다. 다음날 다시 3.0으로 될때도 있구요. 이것때매 엘라지아를 워낙 많이했고 신중히했던터라 테크닉에서 나오는 차이라고는 아무리 생각해도 생각되지않는데..원래 다 이정도 Variation은 있는것인가요? 

 

문제는  Standard가 비율이 이런식으로 달라진 탓인지 동일한 sample로 똑같은 엘라이자를 두번진행했을 때 나오는 농도 값이 많이 다르게 나옵니다.

한번은 100ng/ml 나왔다고하면 한번은 170ng/ml 정도 나오는것이지요..

그래서 제가 정량한 단백질 농도가 맞는지도 확신이 안갑니다. 오차가 너무 큽니다

이런 instability는 해결할 수가 없나요? 엘라이자 고수님들 도움 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ 

 

차라리 키트를 사용하자 하고 싶은데 키트들은 워낙 sensitive해서 manual 에서는 대부분  maximum 500pg/ml  값이더라구요.. (우리랩실의 inhouse ELISA는 10ng/ml부터 serial dilution으로 걸어줍니다) 

문제는 inhouse ELISA결과가 그래도 어느정도맞다면 키트를 사용했을 때 sample을 1000배~2000배 희석후에 sample도 serial dilution으로 걸어야 될 것 같습니다.

이렇게 많이 희석해도 되는것인가요?

 

부족한 질문 읽어주셔서 감사하고 엘라이자 고수분있으시면 팁이라도 좀 주시면 정말 감사하겠습니다 ㅠㅠ

 

 

 

 

 

#ELISA
 
#단백질 정량
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대왕개구리SPEED  |  01.19 16:34  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
동일 STD 양에 따른 OD값의 차이는 조금 문제가 있어 보입니다.
 
1st Ab의 coating은 어떤 식으로 하나요?
 
희석배수는 실험 skill에 문제만 없다면 실험에 가능한 양으로 얼마든지 
 
희석해도 무방합니다.
 
알아카시아꿀  |  01.20 00:43  

답변 감사합니다.

 

그러면 키트로 많이 희석해서 한번 진행해보아야겠네요 

 

1st antibody는 1X PBS에 0.5ug/ml로 희석해주어 코팅하고 

상온에서 overnight incubation해줍니다.

대왕개구리SPEED  |  01.20 14:06  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

coating하는 Ab양을 조금더 올려보세요.

그리고 O/N을 4도에서 해 보세요.

Ab양이 Ag양 보다 모자라는 느낌도 들고 안정적으로 coating이 안되는것

같습니다.

알아카시아꿀  |  01.21 10:51  
아아 감사합니다. 그런가능성을 생각못해봤어요.
감사합니다!
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