실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
Sandwich ELISA 단백질 농도정량 Variation 문제
레벨1 아카시아꿀 (대학원생)
안녕하세요. ELISA assay때문에 전전긍긍하는 석사과정 대학원생입니다.
저는 Sandwich ELISA로 동물세포에서 과발현시킨 단백질발현양을 정량하려고 하고 있습니다. sample은 secretion된 단백질이기에 cell-free supernatant입니다.
과발현 생산량이 목적이다보니 그 농도가 ng/ml~ug/ml 단위까지 가는것같습니다.
저는 ELISA kit를 따로사용하지않고 Inhouse ELISA로 항체, 스탠다드, 버퍼 모두 각각 구입하여 실험실에서 만든 프로토콜로 실험을 진행합니다.
Standard도 잘 잡히는듯 보이고 모두 duplication으로 진행하는데 sample, standard모두 CV값 차이도 크게 없습니다.
다만, 똑같은 스탠다드와 capture, detection antibody를 사용하고 그 외 Strepavidin-HRP, TMB 모두 일정히 같은걸로 사용하는데
O.D값이 할때마다 조금 신경쓰일만큼 다르게 나옵니다. 이런건 크게 고려하지 않아도되는건가요?
예를 들면, 스탠다드를 serial dilution을 1/2씩 했을 때, O.D값이 3.0->2.2->1.1->0.5->.. 이런식으로 오늘 나왔다고 하면 다음날 똑같은 엘라이자를 진행했을때는
2.4-> 1.8-> 1.0->.. 이런식으로 꽤나? 차이가 납니다. 다음날 다시 3.0으로 될때도 있구요. 이것때매 엘라지아를 워낙 많이했고 신중히했던터라 테크닉에서 나오는 차이라고는 아무리 생각해도 생각되지않는데..원래 다 이정도 Variation은 있는것인가요?
문제는 Standard가 비율이 이런식으로 달라진 탓인지 동일한 sample로 똑같은 엘라이자를 두번진행했을 때 나오는 농도 값이 많이 다르게 나옵니다.
한번은 100ng/ml 나왔다고하면 한번은 170ng/ml 정도 나오는것이지요..
그래서 제가 정량한 단백질 농도가 맞는지도 확신이 안갑니다. 오차가 너무 큽니다
이런 instability는 해결할 수가 없나요? 엘라이자 고수님들 도움 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ
차라리 키트를 사용하자 하고 싶은데 키트들은 워낙 sensitive해서 manual 에서는 대부분 maximum 500pg/ml 값이더라구요.. (우리랩실의 inhouse ELISA는 10ng/ml부터 serial dilution으로 걸어줍니다)
문제는 inhouse ELISA결과가 그래도 어느정도맞다면 키트를 사용했을 때 sample을 1000배~2000배 희석후에 sample도 serial dilution으로 걸어야 될 것 같습니다.
이렇게 많이 희석해도 되는것인가요?
부족한 질문 읽어주셔서 감사하고 엘라이자 고수분있으시면 팁이라도 좀 주시면 정말 감사하겠습니다 ㅠㅠ
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