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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 cloning에서 restriction 처리 관련해서 질문이 있습니다.
알레비나스(대학생)  | 01.16 21:19

안녕하세요. 

pPICZaC vector와 insert를 cloning 하였고 transformation 후에 콜로니가 뜬 것을 확인할 수 있었으며, cloning한 것을 colony pcr 했을 때 band가 모두 뜬 것을 확인할 수 있었습니다. band도 제가 원하던 size인 1kb 가까이에서 나왔습니다. 

어제 inoculation 후 오늘 mini prep을 진행하였고, xba1과 EcoR1으로 처리를 하였는데 제가 예측한 곳과 전혀 다른 band가 나왔습니다. restriction enzyme으로 잘렸다면 3.5kbp 부근과 375bp에서 band가 나와야 하는데 나오지 않더군요... 4kb 부근에서 나온 band는 잘리지 않았고, 4kb 이상인 band는 밑에 band가 하나 더 나왔지만 제가 원하던 사이즈는 아니였습니다.

restriction enzyme은 3시간 정도 처리하였으며, xba1과 EcoR1을 cutsmart buffer에서 같이 처리하였습니다. mini prep을 잘못해서 저런 결과가 나온 것일까요?

#cloning
 
#restriction enzyme
 
#mini prep
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  01.17 04:27  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

plasmid가 분리되었다면 miniprep문제는 아닙니다.

plasmid를 제한효소 하나씩 잘라서 먼저 확인하세요. 잘린것을 확인하고 나서 double cut을 하는게 좋을것 같습니다.

물론, 잘린것을 확인할때는 자른 것과 안자른 것을 젤에 같이 걸어서 확인하시고, 이런 질문은 젤사진을 올려주시면 좋은 답이 나올 수 있습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.17 10:16  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

prep.방법에 따라 plasmid가 변하거나 하지 않습니다.

우선 EcoRI, XbaI을 각각 하나씩 잘라 같은 크기, 원하는 크기가 나오는지

확인해 보세요.

개구리CHINyo76_philekorea  |  01.17 13:52  

위의 답변처럼 먼저 각 enzyme으로 restriction을 진행하셔서 linear인지 확인하셔서 각 enzyme의 restriction이 진행되는지 확인하시길 바랍니다.

시간 여유가 있으시면 해당 recombinant DNA의 insert DNA sequence를 확인 해 볼 수 있습니다.

그리고 Restriction enzyme에 문제가 있을것으로 판단되시면 NEB의 EcoRI HF and XbaI 조합에 NEB Buffer 2.1 혹은 Cut Smart buffer를 사용하시면 두 enzyme activity 확보에 문제가 없을것으로 생각됩니다.

 https://nebcloner.neb.com/#!/redigest

참고하시길 바랍니다.

 

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