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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 WB beta actin정량, 적정 develop 시간에 대해서..
알Bonobono..(대학원생)  |  01.14 16:02

안녕하세요 이제 석사 1기 학생입니다.

standard curve를 그리고 계산해서 western 내리면 항상 beta actin 두께가 안맞네요.. 몇 달 째인데 어디가 잘못되었는지 모르겠어서 질문드립니다.

조직은 아니고 배양해서 키운 암세포로 실험합니다.

1.먼저 암세포에 lysis buffer(inhibitor 함유)를 넣고 13,000g에서 10min centrifuge, 상층액만 따서 1.5ml ep-tube에 넣습니다. (lysis buffer 설명서대로)

2. standard curve를 그릴 때는 96well에 dw를 5ul씩 10칸에 미리 담고(5행2열)

그리고 6번 째 행에 10ul BSA씩(1.23mg/mL) 2칸 담습니다. 거기서 5ul를 취해서 serial dilution을 합니다.

3. 1번에서 딴 상층액 3ul와 dw 27ul를 ep-tube에 넣고(1/10 dilution) 5ul씩 2칸의 well에 넣어줍니다(duplication)  

protein assay reagent(A:S=49:1) 10ul를 각 well에 넣습니다. protein assay reagent B를 80ul 넣고 호일로 감싸 10min 동안 기다린 후 595nm에서 흡광도를 측정합니다. 

 

4. BSA의 흡광도를 평균내고 blank(dw의 흡광도) 빼줍니다. x축은 (0, 0.076875, 0.15375, 0.3075, 0.615, 1.23) 으로 하고 standard curve를 그리면 R^2=0.9933이 나옵니다.

5. 원하는 단백질용액의 흡광도에서(BSA의 흡광도 값안에 들어있음) blank값을 빼주고(3ul+dw 27ul 희석했기 때문에 dw의 흡광도를 빼줌) y값에 넣어서 x값을 구합니다. 그리고 구한 값에 10을 곱해줍니다. (아까 3ul+dw 27ul 희석했기 때문) 20ug의 단백질을 넣어줄 것이기 때문에 20으로 나눠주고 dw + dye를 넣어 20ug/25ul을 만듭니다. 그리고 5min boilng, 15min 얼음에 박아 식혀줍니다.

 

6.  loading하고 내립니다. (10% gel, 100V 2h, running buffer는 시판되는 10x짜리 희석해서 쓰고있음

7. 300mV 2h transfer(tranfer buffer는 가루+MeOH섞어서 만듦)

8. 폰슈 + washing + blocking + washing + 1'AB Overnight + washing + 2'AB 2h + washing + ECL 1min

9. 암실에서 필름으로 현상합니다. 깔끔하게 잘 나오는데 두께가 다릅니다. 폰슈로 확인하면 긴가민가 할 정도이고 develop 하고 image J로 값을 측정해보면 control 대비 5~15%정도 차이가 납니다.

 

여기서 궁금한 점이

1. 제가 하는 정량방법 또는 다른 과정에 문제가 있나요?

2. beta actin의 경우 현상 할 때 모든 샘플에서 시간에 따른 두께가 일정하게 증가해야하죠?

3. 제 샘플 같은 경우 5초에서는 첫 번째 밴드가 두껍다가 20초 정도에 거의 밴드 두께가 일정해지는데 이 데이터는 쓸 수 있나요?

4. 만약 제가 20초에 beta actin 두께가 일정해지는 것을 확인했고 이 정량값으로 다른 단백질을 확인했을 때 원하는 결과(늘거나 주는)를 확인했다면 쓸 수 있나요?

 

같은 현상이 반복되니까 어떻게 하는 것이 맞는 것인지 잘 몰라서 질문드립니다. 쓰다보니 글이 길어졌는데 하나라도 속 시원하게 알려주시면 감사하겠습니다..

#actin
 
#western
 
#BSA
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개구리당구왕빠킹  |  01.14 16:34  

전반적으로 실험 과정에서 큰 문제는 없어 보입니다. lysis 시간을 좀 늘려보는 것 정도가 있겠네요(30분 정도 on ice).

항상 actin이 일정하게 나오지는 않습니다. 약재가 actin 발현에 영향을 줄 수도 있으며, pipet의 calibration이 정확하지 않다거나 하는 등의 문제가 있을 수도 있습니다. 눈에 띄는 차이가 나는 것이 아니라면 보통 그냥 데이터로 제시하기는 하는데 애매하다면 fold unit으로 그래프를 첨부하면 문제 없을 것으로 생각됩니다. ECL 반응도 제품, 온도, membrane size 등 변인이 많아서 그에 따른 detection 시간도 변수가 많습니다. 계속 같은 패턴이 나온다면 PI와 film을 나열해두고 discussion을 해보는 것이 어떤가요?

대왕개구리안재진  |  01.14 16:44  

정량결과 비슷하게 걸었는데 Actin 두께가 다르다... 이게 질문이네요...

이 경우 많은 연구자들이 흔히들 격는 문제입니다.

1. 같은 세포의 샘플을 동일하게 8래인 걸어보세요... 똑같이 나온다면 실험상 문제는 없습니다.

2. 그렇다면 정량 혹은 샘플을 만들면서 오차가 발생한것입니다... 이 경우는 최대한 파이펫팅의 횟수를 줄이는것이 오차를 줄이는 방법일수 있습니다.

예를들어 파이펫으로 소량을 취할려고 하지 않고 넉넉히 만들들어 보세요(볼륨이 커지면 오류는 줄어듭니다.)

3. 또 5초 20초에 따라서 문제가 되는 부분이 걱정이 된다면...
같은 세포 샘플을 한 래인에는 20ul 다른 래인에는 10ul 또다른 래인은 5ul를 걸어서 똑같이 20초를 발색해 보세요... 두깨가 서로 차이가 난다면 문제 없을것입니다. 그러나 두깨의 차이가 없다면 20초 발색은 정량 실험에 무의미한 발색시간이 되겠죠... 이럴때는 발색 시간을 줄여야 겠죠...

직접 하다보면은 자기만에 컨트롤 잡는 노하우가 생길것입니다.

 

개구리세오  |  01.14 17:13  
보통 시간을 길게 하면 오버 새츄레이션이 되어 실제로는 밴드 크기가 다른데도 불구하고 같아 보이는 경우가 있습니다. Actin 말도 다른 하우스 키핑 유전자를 사용하는 것도 하나의 방법입니다. 하우스 키핑 유전자를 2-3개 정도 같이 보여 주는 경우도 있습니다.
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