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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
조회 1005  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 fungal RNA isolation 질문드립니다.
올챙이카제카게(대학원생)  |  01.14 14:23

안녕하세요, 지나가던 대학원생입니다.

저는 미생물 중에 bacteria의 분자생물학을 공부하였고, 최근에는 fungi를 이용하여 분자생물학을 적용하여 새로운 분야로 넘어가는 과도기 상태입니다.

 

진행하고 있는 실험은 고체상태의 배지에서 fungi와 천연추출물간 상호작용에 관한 연구를 진행하고 있습니다.

 

저는 고체배지에서 자라는 fungi를 모아서 RNA를 추출하고자 합니다.

대부분의 경우, 곰팡이의 RNA 추출은 액체배양을 통해 harvest한 뒤에, pellet을 liquid nitrogen을 이용하여 분쇄시키고, manual 또는 kit로 진행하는 것 같습니다.

 

비슷하게 따라하고자, 

저는 고체배지에서 자라는 곰팡이를 가로x세로(2x1cm2) 로 PDA배지를 잘라서, 액체질소와 막자사발을 이용하여 RNA를 추출하였습니다.(Q사의 RNA 추출 kit 이용)

문제는 nanodrop의 결과입니다.

260/280은 2.02로 괜찮게 나왔지만, 농도가 40ng/ul(40ul elution), 260/230은 0.67로 매우 안좋은 quality를 나타냈습니다.

(처음 시도였던것 치고, 운이좋게 RNA전기영동에서 28S, 18S band를 확인하였습니다.)

이러한 원인 중 하나로 여겨지는 것은, PDA배지 성분 중 carbohydrate의 성분이 같이 용출된 것으로 추정하고 있습니다.

 

이러한 이유로, PDA 배지에서 RNA를 새로 추출하고자 새로운 방법을 고안하였습니다.

새로 고안한 방법은

->PDA 배지에서 생장 중인 mycelia 부근만 piece를 자르고, 50ml 튜브에 넣은 뒤

->tween 20이 첨가된 0.03% D.W로 wash 이후, agar에서 떨어져나온 fungi를 centrifuge를 통해 harvest 진행 후

->pellet를 nitrogen을 이용하여 분쇄한 뒤, RNA를 추출하는 방법을 고안하였습니다.

 

이 방법에 첨언을 해주시거나 또는, 고체배지의 fungal RNA를 추출하는 방법을 아시는 분계시면 도움을 주셨으면 감사하겠습니다.

#곰팡이 RNA
 
#fungal RNA
 
#agar
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.14 15:40  

배지를 같이 자르면 안좋고 액제배양을 하면 원심분리해서 pellet을 사용하고

plate에서 배양하면 plate에 멸균 buffer를 넣고 10분 정도 방치후 균사를

scraper로 긁어서 원심분리하여 pellet을 사용하면 됩니다.

OD값 보다 전기영동해서 band pattern을 보면 quality를 확실히 알수 있습니다.

올챙이카제카게  |  01.17 11:52  

SPEED님께,

 

멸균buffer를 이용하는 게 무엇을 뜻하는지를 몰라서,

D.W에 1mM MgSO4가 섞인 것을 이용하여

10분간 PDA 배지에 반응시켰습니다.

 

D.W에 떠다니는 균사를 scraper가 없어, 백금이로 긁어모아서 사용하였습니다.

이후 harvest를 진행하였고 pellet을 막자로 잘게 갈아주어 RNA를 추출하였습니다.

하지만, 이전과 비슷한 수준의 RNA가 추출되었습니다.

 

제가 SPEED님의 말씀을 잘못이해했나 싶어서 남겨요.

대왕개구리SPEED  |  01.17 12:11  

어떤 방법으로 harvest를 해도 RNA quality에는 큰 문제는 없습니다.

가장 영향을 주는 요인으 cell wall을 파쇄하는 방법입니다.

높은 수율로 cell wall을 파쇄하면 할수록 RNA 분리에 좋습니다.

harvest 이후 단계를 점검해 보는 것이 좋을 듯합니다.

그리고 DNA, RNA 추출 문제는 전기영동 사진을 첨부하면 문제점 해결에

많은 도움이 됩니다.

 

올챙이카제카게  |  01.17 13:14  
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (33 KB)
이미지 첨부파일

첫번째 질문 시,

RNA 추출했던 사진입니다.

RNA ng/ul 260/280 260/280
1 49.5 2.02 0.48
2 40.2 2.02 0.67

RNA 전기영동 사진입니다. (elution volume : 40ul)

RNA-sequencing을 의뢰할 목적으로, 

최소 5 ug 이상은 필요할 것 같은데, 양이 너무 부족합니다.

올챙이카제카게  |  01.17 13:17  
첨부파일 파일첨부: 그림2.png (81 KB)
이미지 첨부파일

SPEED님께서 말씀하신대로 추출한 방법입니다.

RNA ng/ul 260/280 260/230
1 48.7 2.02 0.59
2 46.5 2.00 0.61

사진은 500 ng으로 정량하여 전기영동한 사진입니다.

 

260/230의 quality가 너무 떨어지고, RNA 양 자체도 너무 적습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.17 14:09  

사용 kit가 plant or fungi RNA prep. kit인가요?

pellet양을 좀더 늘여서 추출을 해보고 확인을 해야 할것 같고 quality는 protocol을

봐야지 개선 가능할 단계가 있는지 아니면 prep. 방법을 변경해야 할지가

알수 있겠습니다.

꽃개구리느림보  |  01.18 00:17  
RNA seq에 그정도면 충분한 양입니다. 그냥 보내 보세요 자체적으로 qc를 하고나서 실험을 진행하니까 걱정할 필요 없어요.
농도가 낮은 것은 시료를 늘이면 되고.
260/230은 RNA seq 과정에서 추가적인 정제 과정이 있기 때문에 큰 문제 아닙니다.
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