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질문 비장세포 증식능
알흥정망청(대학원생)  |  01.13 14:23

안녕하세요 비장세포 증식능 실험을 하게된 대학원생입니다

저희 연구실에서 본실험을 진행해본적이없어 디테일한 실험프로토콜을 확립하고자 질문올리게 되었습니다 많은 피드백 부탁드리겠습니다..!

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  1. 마우스 희생하여 비장을 적출한후 ice하에서 냉장상태의 RPMI1640배지로 워싱하고 100µm mesh에 pestle 으깨며 배지로 셀을 모은다
  2. 4도씨 1000rpm 10min간 원심분리
  3. 상층액은 제거하고 RBC버퍼로 적혈구를 제거한다(RBC버퍼의 자체프로토콜을 따름)
  4. 4도씨 1000rpm 10min간 원심분리하고 DPBS로 세척한다(1~2회
  5. 세포 계수 후, FBS첨가 RPMI1640으로 희석하여 96well에 농도에 맞게 분주한다.
  6. 각 well에 conA와 LPS를 첨가하고 일정시간 배양한다
  7. MTT를 가하고 4시간 배양한다
  8. 4도씨 1000rpm 5min간 원심분리하여 상층액을 제거한다.
  9. DMSO를 가하여 흡광도를 측정한다

-------------------------------------------------------

궁금한 부분은

1. 이때 배지(RPMI)에 항생제를 첨가하는것아 맞는것인지

2. 온도 조건이 세포를 분리할때는 계속 4도에서 하는것이 세포 생존능력에 좋은것인지

3.부착능이 없는 세포인데 만약 MTT를 진행할때 phenol red 가없는 배지라면 원심분리없이 DMSO까지 가하는것인지, 그 자세한 프로토콜

이 가장 궁금하며 혹 작성한 프로토콜에 문제나 의문점이 생기는 부분이 있다면 많은 피드백 부탁드립니다.

참고문헌이 있으시다면 함께 부탁드리겠습니다...

(이메일:koof97@naver.com)

감사합니다..

#primary cell
 
#splenocyte
 
#spleen
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리당구왕빠킹  |  01.14 13:45  

연구실마다 세부 프로토콜은 다를테니 적당한 수준에서 말씀을 드리자면,

1. 이때 배지(RPMI)에 항생제를 첨가하는것아 맞는것인지

 ▶ 항생제 들어있는 배지 쓰시면 됩니다.

2. 온도 조건이 세포를 분리할때는 계속 4도에서 하는것이 세포 생존능력에 좋은것인지

 ▶ 짧은 시간이라 큰 영향은 없겠지만, 보통 4도로 많이 수행합니다.

3.부착능이 없는 세포인데 만약 MTT를 진행할때 phenol red 가없는 배지라면 원심분리없이 DMSO까지 가하는것인지,

 ▶ 저는 MTT를 따로 하진 않는데, MTT 자체가 보통 solution 형태로 사용하지 않나요? MTT solution 제거하고 DMSO로 crystal dye 녹여내려면 cfg 과정 필요한 것으로 보입니다.

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