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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 RNA extraction 후 DNase I 처리시 phenol chloroform extraction하는데 이 때 phenol의 pH가 궁금합니다.
알Minsuhammm(대학원생)  |  01.09 18:37

식물에서 Trizol을 이용하여 total RNA를 추출하였습니다. 중간 과정 중 purity를 높이기 위해 phenol chloroform extraction을 추가하였고 이 때 사용한 phenol은 phenol:chloroform (5:1) pH 4.3입니다.

이후 DNase I treatment를 진행하였습니다. Takara사의 DNaseI treatment protocol에는 phenol chloroform extraction시 phenol을 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)로 사용하고 pH는 나와있지 않았습니다. 보통 RNA는 acidic phenol에서 안정하므로 원심분리하였을 때, aqueous phase에 RNA가 있다고 알고 있습니다. 그래서 저는 total RNA를 추출할 때 사용한 phenol:chloroform (5:1) pH 4.3을 사용하였습니다.

질문드리고 싶은것은

1. DNase I treatment시 Takara사에서 말하는 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)의 pH는 몇인지

2. DNase I treatment시 phenol:chloroform (5:1) pH4.3을 사용하여도 괜찮은지

3. 연구실 사람들은 DNase I treatment시 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), saturated with 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA를 사용하였다고 하는데 이 phenol을 사용해도 상관없는지

4. Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), saturated with 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA 시약 옆에 pH range: 6.5-6.9 (pH of phenolic phase)라고 되어 있는데, Tris의 pH가 8.0인건지, 시약 아래층의 phenol은 pH가 8.0이라는건지 6.5-6.9라는 건지

입니다.

#RNA
 
#phenol
 
#DNase I treatment
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대왕개구리SPEED  |  01.09 18:58  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

산성, 중성 페놀 모두 사용가능하며 적혀있는 pH는 페놀의 pH입니다.

개구리Lucid  |  01.09 19:03  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

보통 protocol들을 보면 RNA prep시는 acidic phenol을 사용하라고 되어 있지만, 저도 윗분 말씀처럼 중성을 써도 수율이나 purity에서 크게 차이는 없었습니다.

알Minsuhammm  |  01.09 19:21  

두 분 모두 답변 감사드립니다.

몇 가지 더 여쭤보고 싶은것이

Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), saturated with 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA 시약 아래층의 phenol은 pH가 8.0이라는 말씀이신가요?

중성을 사용해도 되는 이유는 중성 phenol 사용시 aqueous phase에 DNA와 RNA가 모두 남게되지만 DNase I을 처리하였기 때문에 DNA는 없어졌을것이라 생각하고 크게 상관안하는건가요?

대왕개구리SPEED  |  01.09 19:32  

1. Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), saturated with 10mM Tris, pH 8.0,

1mM EDTA 시약 아래층의 phenol은 pH가 8.0이라는 말씀이신가요?

: 네.. 그러나 실제 측정해보면 8.0보다는 낮습니다.

2. 중성을 사용해도 되는 이유는 중성 phenol 사용시 aqueous phase에 DNA와

RNA가 모두 남게되지만 DNase I을 처리하였기 때문에 DNA는 없어졌을

것이라 생각하고 크게 상관안하는건가요?

: DNA를 효율적으로 제거하기 위해서 산성 페놀을 사용하며 정상적으로 RNA

추출이 잘되면 DNA는 모두 제거 됩니다.

DNA가 남아있다면 RNA 추출이 잘안된겁니다.

RNA 추출 시에는 산성 페놀, RNA 시료 중 DNase 제거시에는 산성, 중성페놀

모두 사용가능합니다.

 

올챙이카제카게  |  01.15 09:26  

최종적으로 RNA를 추출하는 것이 목적인 것이죠?

phenol은 pH4~5에 해당하는 제품을 계속 사용한다고 생각합니다.

DNA는 2'에 -H 라서 phenol (pH 8.0)을 사용합니다.

RNA는 2'에 -OH -> 산성의 성질을 나타내기에 pH4~5의 phenol을 사용합니다.

 

Phenol: Chloroform:Isoamylalcohol = 25:24:1 (PCI) 을 사용하는 것을 권장합니다.

DNA 실험은 phenol을 pH8.0을 이용하여 PCI 용액을 제조하면 됩니다.

RNA 실험은 phenol pH 4~5를 사용하여 PCI를 제조합니다.

 

답변

1. 저는 PCI 용액을 2가지를 제조하였지만, 실제 pH를 측정해보지 않았습니다. (phenol의 pH에 따라 2종류로 나뉘고, 이에따른 pH가 동일하다고 가정하고 실험을 진행하였습니다.)

2. maniatis manual(molecular cloning)에 따라 25:24:1을 권장합니다.

3. 자신의 목적에 따라 다르다고 생각합니다.

plasmid나 gDNA 추출시, (물론 DNase1을 사용하지 않겠지만) Phenol pH8.0을 사용할 것이며, 이에따른 PCI용액을 제조할 것입니다.

RNA 추출시, DNase1을 처리하면서, 이를 불용화시킬 목적으로 PCI를 처리할 때는 phenol의 pH 4.0을 사용할 것입니다.

4. 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA 용액의 pH가 8.0으로 여겨지며, 해당 용액을 phenol의 녹이면, phenol의 실제 pH가 6.9를 뜻하는것 같습니다. 저도 여기서 처음 알았네요..

정 궁금하면, hood에서 지시약 으로 RNA를 추출하는 것이 목적인 것이죠?

 

phenol은 pH4~5에 해당하는 제품을 계속 사용한다고 생각합니다.

 

DNA는 2'에 -H 라서 phenol (pH 8.0)을 사용합니다.

 

RNA는 2'에 -OH -> 산성의 성질을 나타내기에 pH4~5의 phenol을 사용합니다.

 

 

 

Phenol: Chloroform:Isoamylalcohol = 25:24:1 (PCI) 을 사용하는 것을 권장합니다.

 

DNA 실험은 phenol을 pH8.0을 이용하여 PCI 용액을 제조하면 됩니다.

 

RNA 실험은 phenol pH 4~5를 사용하여 PCI를 제조합니다.

 

 

 

답변

 

1. 저는 PCI 용액을 2가지를 제조하였지만, 실제 pH를 측정해보지 않았습니다. (phenol의 pH에 따라 2종류로 나뉘고, 이에따른 pH가 동일하다고 가정하고 실험을 진행하였습니다.)

 

2. maniatis manual(molecular cloning)에 따라 25:24:1을 권장합니다.

 

3. 자신의 목적에 따라 다르다고 생각합니다.

 

plasmid나 gDNA 추출시, (물론 DNase1을 사용하지 않겠지만) Phenol pH8.0을 사용할 것이며, 이에따른 PCI용액을 제조할 것입니다.

 

RNA 추출시, DNase1을 처리하면서, 이를 불용화시킬 목적으로 PCI를 처리할 때는 phenol의 pH 4.0을 사용할 것입니다.

 

4. 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA 용액의 pH가 8.0으로 여겨지며, 해당 용액을 phenol의 녹이면, phenol의 실제 pH가 6.9를 뜻하는것 같습니다. 저도 여기서 처음 알았네요.. 궁금하시면, phenol 용액을 지시약종이에 묻혀서 확인해보시는게 어떤지요..

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