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질문 qPCR Ct value 관련 질문있습니다.
개구리아이스티(과기인)  |  01.09 16:10

endogenous하게 발현되는 특정 유전자를 확인하고자하는데

이게 샘플마다 Ct value가 많이 다르게 나옵니다.

 

Target

GAPDH

vector 1st

27.82

15.19

vector 2nd

28.42

14.99

vector 3rd

30.11

14.95

vector 모두 HeLa 세포이며, myc-vector가 transfection된 상태입니다.

그러니깐 endogenous RNA level을 확인할 수 있구요.

qPCR 40cycle로 실행했으며

GAPDH는 괜찮다고 보여집니다. 문제는 target RNA 발현량인데요

40 cycle로 돌렸을때 Ct value가 35로 나온다면 저는 RNA 발현이 없다고 판단합니다. 하지만 현재 Target RNA는 분명히 발현이 되는것으로 보입니다. 하지만 같은 세포에 같은 조건으로 transfection된 세포들이구요. 차이점은 세포 passage만 다르다는겁니다. (이건 RNA 발현에 큰 영향을 미칠것으로 생각하지 않습니다.)

RNA degradation이라고 하기에는 GAPDH 레벨도 안정적이라 RNA 자체, 그리고 정량에는 문제가 없어보입니다.

이전에 했던 실험에서도 Ct value variation이 컸습니다. 27~35로 같은 세포에서 나온 결과라고 생각되지 않을 정도입니다.

 

Ct value가 낮긴하다 그래도 40 cycle로 돌렸을 때 27이 나온다면 분명히 발현이 된다고 여겨지는데 어째서 샘플마다 발현량 차이가 크게 나오는걸까요..?

 

 

#qPCR
 
#HeLa
 
#gene expression
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올챙이CHINyo76_philekorea  |  01.09 18:46  

transfection 경험이 미천하지만 혹시 stable cell이 아니라 transient cell이라면 오차가 있을 수 있을 것이라 생각됩니다. 

개구리Lucid  |  01.09 19:01  

Ct값이 큰, 즉 발현량이 낮은 유전자일수록 Ct 값의 variation이 커지는 경향이 있습니다. 따라서 대표값을 정하기 위해 반복 실험을 하고 통계 처리를 하는 것이지요. 저 정도 편차면 크게 실험이 잘못된 것 같지는 않습니다.

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