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질문 plasmid 구매 방법 (애드진)
올챙이낑깡낑깡(대학원생)  | 01.09 13:35

안녕하세요 초보 대학원생입니다

제가 원하는 단백질을 발현시킬 수 있는 plasmid를 구매하고자 합니다.

vector의 promoter는 T7 promoter를 사용할 예정입니다.

single origin이구요. 

 

단백질을 clonig한 후 restriction enzyme 등을 이용하여 원하는 부위의 domain만 발현시킬 계획입니다. 

 

addgene에서 plamid를 검색하고 제가 찾고자 하는것과 일치하는지 확인하고 싶을 때,

 

1. 검색창에 단백질 이름만 검색해서 나오는 것들을 확인하면 되나요?

2. 원하는 서열이 다 들어가있는지는 어떻게 확인하나요?

3. domain 과 domain 사이 restriction enzyme 서열이 존재하는지는 어떻게 확인하나요?

 

4. E.coli/Bacteria 용인지는 어떻게 확인하나요?

#plasmid
 
#addgene
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  01.09 16:25  

질문을 명확하게 해야 좋은 답변이 나옵니다.

 

1. 검색창에 단백질이란 무슨 의미죠?

plasmid를 구입할건가요? 아니면 어떤 유전자가 삽입된 plasmid를 구입할건가요?

질문은 원하는 단백질을 발현시킬 plasmid를 구입한다고 하고, 단백질(의 유전자)를 클로닝한다고 하고 나서는 또 검색창에 단백질을 검색하는건 뭐죠?

혹시 발현시킬 plasmid는 T7 promoter를 사용하는 plasmid를 사고, 또 하나 더, 어떤 원하는 유전자가 삽입되어 있는 또다른 plasmid를 구입하겠다는 의미인가요?

T7 프로모터를 사용하는 plasmid는 pET15b 같은 대장균 발현용 벡터가 많이 사용됩니다.

 

2. 원하는 서열이 다 들어가 있는지는 addgene에서 검색된 plasmid에 서열이 같이 제공됩니다. 그걸 다운받아서 orf 가 있는지 확인하고 그 orf sequence를 BLAST 돌려서 보고된 완전한 orf인지 확인해야 합니다.

 

3. domain과 domain 사이라는 것이 무슨 의미인지 모르겠군요.

어쨋든 제한효소 서열이 존재하는지는 프로그램을 돌려서 찾아야 합니다. 실험실에서 사용하는 제한효소서열 검색 프로그램이 없다면 NEB site에 들어가서 NEBcutter 를 돌리면 서열내에 존재하는 제한효소 site를 알 수 있습니다.

 

4. Addgene에서 어떤 plasmid를 검색해서 찾으면 plasmid map, sequence, 복제원점의 종류, 항생제 마커 종류, 어느 대장균에서 배양할지 등의 정보가 같이 딸려 나옵니다.

그거 보고 하면 되고요.

map을 보면 oriE 가 표시되면 댖방균 복재원점이고요. bla, kan, chl hyg 등 세균에서 사용하는 항생제 마커가 있다면 세균에서 사용하는 plasmid입니다.

 

 

 

단백질을 clonig한 후 restriction enzyme 등을 이용하여 원하는 부위의 domain만 발현시킬 계획입니다. 

 

이건 무슨의미죠?

보통 발현시킬 domain만 PCR로 증폭해서 클로닝을 하면 되지 왜 클로닝을 먼저하고나서 자시 제한효소로 자르는 과정을 하죠?

 

클로닝, domain 등의 개념이 불분명한가요?

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