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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 Cloning colony가 안 뜹니다..
알siasia(대학생)  |  01.06 23:15

 안녕하세요, Cloning 관련하여 몇달째 고생중인 학생입니다 ㅠㅠ

실험실 선배들중에 Cloning을 해본 사람이 없어서 처음이라 엄청 헤매고 있는데 많은 회원님들의 조언 부탁드립니다! 

 마우스의 특정 유전자의 cDNA를 이용하여 Vector와 겹치지 않는 Enzyme site를 찾아 Primer의 F와 R의 각 site에 Enzyme sequence를 넣어 sticky end로 직접 만들었습니다. 그리고 Snap gene을 이용하여 연결되는 것을 확인하였습니다.

 먼저 PCR Amplication을 통해 Band들을 확인하였고, PCR Clean up을 진행하였습니다. Nano-drop dsDNA를 통해 Concentration도 확인하고 Band도 확인하였습니다. ( PCR Clean up 때 Washing buffer로 사용하는 EtOH로 인해 OD260/230이 낮았고 Agarose gel running할 때 well에서 둥둥 떠다니며 잘 이루어지지 않음. ) Enzyme cutting은 37도에서 한시간 진행하였습니다. 그리고 Gel extraction을 진행하고 membrane binding solution과 1:1로 반응시켜 녹여준 후, clean up 과정을 진행하였습니다. (이 때도 마찬가지로 Washing buffer로 사용하는 EtOH로 인해 OD260/230이 낮았고 Agarose gel running할 때 well에서 둥둥 떠다니며 잘 이루어지지 않음. ) 그리고 Ligation은 1:1 ~ 1:10까지 모두 진행해보았는데도 LB+Kan(50ug/ml) 에서 Colony가 한번도 뜨지 않았습니다 ㅠㅠ.. 

무엇이 문제일까요..? 

Gel extraction 할 때에 특별한 팁이 있을까요? 그 때에 농도가 너무 떨어지는 것 같고 Washing buffer가 너무 남아있는 것 같아 퀄리티도 안 좋은 것 같은데 팁이 있는 지 궁금합니다! 

긴 글 읽어주셔서 감사합니다 :) 

#Cloning
 
#vector
 
#insert
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.06 23:38  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cloning에서 colony가 안나올 때 점검해야 할 항목이 있습니다.

1. CP cell의 TF 효율 확인

2. Vector, insert의 ligation 확인

위 2항목을 확인 했나요?

gel elution할 때 원심분리를 잘 하면 EtOH의 영향은 거의 없습니다.

전기영동 시 well에 떠다닌다는 뜻은 어떤 의미 인가요?

혹시 ligation 전 vector와 insert의 전기영동 사진 있나요?

cloning에 vector, insert 준비가 90% 이상 영향을 줍니다.

알siasia  |  01.07 00:04  

SPEED님 답변 감사합니다!! 

 

1. CP cell의 TF 효율 확인

 - Enzynomics에서 구매하여 사용하고 있어서 효율은 확인하지 않았었습니다! 그리고 1년 전에 실험실에서 계셨던 선배가 만들어놓았던 DH5Alpha cell이 있어서 다른 Plasmid로 Transformation , mini prep까지 진행은 해보았었습니다.

 - 혹시 구매하여 사용하는 cell도 따로 효율을 확인해야하나요?

2. Vector, insert의 ligation 확인

 - Ligation을 확인할 수 있는 방법이 있을까요? enzyme cutting 전 후 Ligation 전 후 sample들을 로딩해보면 차이가 날까요? ㅠㅠ

gel elution할 때 원심분리를 잘 하면 EtOH의 영향은 거의 없습니다.

 - 원심분리는 16000xg로 1min~5min 진행하고있습니다.

전기영동 시 well에 떠다닌다는 뜻은 어떤 의미 인가요?

 - PCR celan up troubleshooting에 보면 Purified DNA floats out of the well when loaded on a gel 과 같은 문제에 대해 Ethanol carryover. Be certain that the Membrane Wash Solution is not carried over from the wash steps. If the column has been wet, empty the Collection Tube and recentrifuge the column assembly for 1 minute. Centrifuge the SV Minicolumn for 5 minutes to remove residual Membrane Wash Solution. After washing, centrifuge the column assembly with the microcentrifuge lid open or off (Section 5.A., Step 5; Section 5.B., Step 5) to allow evaporation of any residual ethanol. Add 3X loading dye to the DNA sample before loading onto the gel. 다음과 같이 써있습니다.. 저는 6x Loading dye를 사용하고 있습니다. 

대왕개구리SPEED  |  01.07 00:14  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
CP cell 구매한지 얼마되지 않았으면 확인하지 않아도 될것 같습니다.
Ligation 후 전기영동 하면 확인 가능합니다.
Ligation이 되는지 안되는지 확인도 안하고 TF하면
결과가 잘나올지 알수없습니다.
알siasia  |  01.07 00:28  

Speed님 다시한번 답변에 감사드립니다 :)

당장 내일 Gel extraction 부터 진행하여 차근차근 되짚어보겠습니다!

도움 감사드립니다 :)

혹시 Gel extraction할 때에 Agarose gel은 Autoclave해야한다거나 전기영동 시특정 Buffer를 사용해야하나요? (현재는 TAE Buffer를 사용하고 있습니다.) 

 

대왕개구리SPEED  |  01.07 00:30  
Agarose는 TAE등의 전기영동 buffer에 녹여서
사용하면 됩니다.
ㅇㅇ  |  01.07 09:02   

comp. cell 효율의 문제라기보단 프로토콜상 문제로 효율이 현저하게 떨어질 수 있으니 이미 가지고 있는 DNA 1 ng 정도를 transformation해서 효율 확인하시기 바랍니다.

그리고 1:10이 안 나오면 1:1도 해보시고 1:100도 해보세요.

마지막으로 PCR product에 enzyme이 아예 안 먹었을 수도 있을 것 같은데, cDNA 뜰 때 프라이머에 enzyme site 앞뒤로 여유 사이트 넣으셨나요?

앞에 여유 사이트 없으면 아예 안 잘리는 enzyme도 있습니다. 그래서 기본 3개 정도 넣어주는 것이 좋습니다. 이 부분은 클로닝 처음 하는 사람은 잘 모르는 경우가 많아요.

예를 들면 GAT (여유 site, 랜덤) GAA TTC (enzyme site) XXXXXXXXX (상보서열) -> GATGAATTCXXXXXXXXXXX 이런 식으로 프라이머 디자인 하세요.

tlawogus7676@snu.ac.kr  |  01.07 20:28   
첨부파일 파일첨부: Enzyme cut.jpg (195 KB)
이미지 첨부파일

Ligation 이 잘되었는지 확인해봐야 할것 같습니다.

Snap gene 을 사용하고 계신다고 하니, 간단하게 Restriction enzyme (RE) cut 으로 확인하는 방법을 알려드릴게요. 같은 종류의 버퍼에서 활성이 100% 인 RE 두개를 고르셔야 합니다.

1. Insert 안의 unicutter RE 한개

2. Vector 쪽의 unicutter RE 한개

3. 선택지가 없다면 dual cutter 중에 Insert 와 vector 를 각각 한번씩 자르는 RE 한개 

그다음, Snap gene 에서

tools - agarose gel simulation - cut with RE1 + RE2

이렇게 해서 Gel run 한거랑 비교해보시면 될것 같습니다.

개구리세오  |  01.08 07:03  

클로닝이 잘 될때야 금방이지만 안되면 클로닝 만큼 골치 아픈 것도 없는 것 같습니다. 

질문자님이 여러 방법으로 잘 하셨겠지만, 혹시나 해서 질문드립니다.

Kan을 사용하셨다고 했는데, 벡터에 Kan이 있는지 확인하셨는지요?

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