cloning에서 colony가 안나올 때 점검해야 할 항목이 있습니다.
1. CP cell의 TF 효율 확인
2. Vector, insert의 ligation 확인
위 2항목을 확인 했나요?
gel elution할 때 원심분리를 잘 하면 EtOH의 영향은 거의 없습니다.
전기영동 시 well에 떠다닌다는 뜻은 어떤 의미 인가요?
혹시 ligation 전 vector와 insert의 전기영동 사진 있나요?
cloning에 vector, insert 준비가 90% 이상 영향을 줍니다.
-
레벨1
siasia
(대학생)
-
20.01.07 00:04
SPEED님 답변 감사합니다!!
1. CP cell의 TF 효율 확인
- Enzynomics에서 구매하여 사용하고 있어서 효율은 확인하지 않았었습니다! 그리고 1년 전에 실험실에서 계셨던 선배가 만들어놓았던 DH5Alpha cell이 있어서 다른 Plasmid로 Transformation , mini prep까지 진행은 해보았었습니다.
- 혹시 구매하여 사용하는 cell도 따로 효율을 확인해야하나요?
2. Vector, insert의 ligation 확인
- Ligation을 확인할 수 있는 방법이 있을까요? enzyme cutting 전 후 Ligation 전 후 sample들을 로딩해보면 차이가 날까요? ㅠㅠ
gel elution할 때 원심분리를 잘 하면 EtOH의 영향은 거의 없습니다.
- 원심분리는 16000xg로 1min~5min 진행하고있습니다.
전기영동 시 well에 떠다닌다는 뜻은 어떤 의미 인가요?
- PCR celan up troubleshooting에 보면 Purified DNA floats out of the well when loaded on a gel 과 같은 문제에 대해 Ethanol carryover. Be certain that the Membrane Wash Solution is not carried over from the wash steps. If the column has been wet, empty the Collection Tube and recentrifuge the column assembly for 1 minute. Centrifuge the SV Minicolumn for 5 minutes to remove residual Membrane Wash Solution. After washing, centrifuge the column assembly with the microcentrifuge lid open or off (Section 5.A., Step 5; Section 5.B., Step 5) to allow evaporation of any residual ethanol. Add 3X loading dye to the DNA sample before loading onto the gel. 다음과 같이 써있습니다.. 저는 6x Loading dye를 사용하고 있습니다.
CP cell 구매한지 얼마되지 않았으면 확인하지 않아도 될것 같습니다.
Ligation 후 전기영동 하면 확인 가능합니다.
Ligation이 되는지 안되는지 확인도 안하고 TF하면
결과가 잘나올지 알수없습니다.
-
레벨1
siasia
(대학생)
-
20.01.07 00:28
Speed님 다시한번 답변에 감사드립니다 :)
당장 내일 Gel extraction 부터 진행하여 차근차근 되짚어보겠습니다!
도움 감사드립니다 :)
혹시 Gel extraction할 때에 Agarose gel은 Autoclave해야한다거나 전기영동 시특정 Buffer를 사용해야하나요? (현재는 TAE Buffer를 사용하고 있습니다.)
Agarose는 TAE등의 전기영동 buffer에 녹여서
사용하면 됩니다.
comp. cell 효율의 문제라기보단 프로토콜상 문제로 효율이 현저하게 떨어질 수 있으니 이미 가지고 있는 DNA 1 ng 정도를 transformation해서 효율 확인하시기 바랍니다.
그리고 1:10이 안 나오면 1:1도 해보시고 1:100도 해보세요.
마지막으로 PCR product에 enzyme이 아예 안 먹었을 수도 있을 것 같은데, cDNA 뜰 때 프라이머에 enzyme site 앞뒤로 여유 사이트 넣으셨나요?
앞에 여유 사이트 없으면 아예 안 잘리는 enzyme도 있습니다. 그래서 기본 3개 정도 넣어주는 것이 좋습니다. 이 부분은 클로닝 처음 하는 사람은 잘 모르는 경우가 많아요.
예를 들면 GAT (여유 site, 랜덤) GAA TTC (enzyme site) XXXXXXXXX (상보서열) -> GATGAATTCXXXXXXXXXXX 이런 식으로 프라이머 디자인 하세요.
-
tlawogus7676@snu.ac.kr
(비회원)
-
20.01.07 20:28
Ligation 이 잘되었는지 확인해봐야 할것 같습니다.
Snap gene 을 사용하고 계신다고 하니, 간단하게 Restriction enzyme (RE) cut 으로 확인하는 방법을 알려드릴게요. 같은 종류의 버퍼에서 활성이 100% 인 RE 두개를 고르셔야 합니다.
1. Insert 안의 unicutter RE 한개
2. Vector 쪽의 unicutter RE 한개
3. 선택지가 없다면 dual cutter 중에 Insert 와 vector 를 각각 한번씩 자르는 RE 한개
그다음, Snap gene 에서
tools - agarose gel simulation - cut with RE1 + RE2
이렇게 해서 Gel run 한거랑 비교해보시면 될것 같습니다.
클로닝이 잘 될때야 금방이지만 안되면 클로닝 만큼 골치 아픈 것도 없는 것 같습니다.
질문자님이 여러 방법으로 잘 하셨겠지만, 혹시나 해서 질문드립니다.
Kan을 사용하셨다고 했는데, 벡터에 Kan이 있는지 확인하셨는지요?