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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 cell에서 RNA prep을 하는데 고질적인 문제가 발생합니다
알해보는거야(대학원생)  |  01.06 11:00
첨부파일 파일첨부: GAPDH 합성, RNA loading.pptx (202 KB)

지금 고질적인 문제로 mRNA expression 확인하는데 문제가 있습니다.

TRIzol을 이용해서 total RNA를 뽑고, 이를 cDNA합성 후에 사용하려고 하는데,

sample을 6~7개 정도 prep을 진행하면, 5ug의 양으로 cDNA를 합성(bioneer kit 사용)하고,

이를 GAPDH PCR을 통해 확인하면, 첨부파일 처럼 전체적으로 균일하게 합성되지 않고,

들쭉날쭉한 결과가 반복되어 나오고 있습니다.

RNA의 농도와 순도는 나쁘지 않은 것 같지만, 항상 어느순간 degradation 되는 것으로 생각됩니다.

 

그 동안 tip, tube, DEPC water 등 material을 실험마다 새로 써보기 했지만, 완전히 개선되진 않았습니다

심지어, 저희 lab protocol은 TRIzol 사용할 때, RT가 아닌 ice에서 진행하면서 반응시간을 길게 가져 degradation을 더 안되게 하려는 방법을 쓰고 있습니다.

같은 실험실의 박사님은 RNA 뽑을 때, 문제가 없어서 더더욱 저에게서 문제가 발생되는거 같은데

해결할 방법이 보이지 않으니 답답합니다

 

mRNA level을 확인해야 하는데, cDNA가 준비되지 않으니 실험도 진행되지 못하고 막힌상태입니다.

혹시 RNA prep하시는데 중요한 부분이라던지, 혹시 제가 간과하고 있는 부분이 있으면 도움부탁드립니다

#RNA
 
#extraction
 
#degradation
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
ㅇㅇ  |  01.06 11:26   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

첨부하신 파일을 보니 RNA 상태가 매우 매우 안 좋습니다.

 

RNA prep. 후 나노드랍 등으로 농도, 순도 보는건 크게 의미가 없습니다. 바로 젤에 걸어서 28s 18s 밴드가 선명하게 잘 보이는지 제일 우선으로 확인하세요.

 

그리고 cDNA 합성하는 양이 너무 많은데 그 kit의 프로토콜이 그런건가요?

 

일단 문제는 RNA로 보여지기 때문에 전체 reagent를 다 갈아서 실험해보세요. 클로로포름 등도요. 다른 사람 RNA를 젤에 걸었을 때 괜찮게 나오는거면 본인의 실험 습관에 분명히 문제가 있는 겁니다.

개구리아이스티  |  01.06 15:28  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

우선 본인이 사용하는 테이블 및 기기들은 RNaseZap 혹은 0.5% SDS, 3% H2O2, 0.05M NaOH solution을 만들어서 꼼꼼히 닦고, RNA prep 과정에서 쓰는 용액들 모두 바꿔보세요. tip이나 tube 모두 autoclave 해야하구요. 그리고 tube 뚜껑 열때 뚜껑 안 쪽에 손이 안닿도록 주의하세요. 

대왕개구리SPEED  |  01.06 15:39  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

RNA가 DNA와 비교할 때 분해가 잘되는 건 사실이지만 실험 중에 분해되는

현상이 잘 일어나지 않습니다.

RNA 상태가 안좋은 것은 거의 대부분 prep. 방법의 문제이며 protocol을 최대한

지켜서 실험해 보세요.

RNA 추출이 DNA 보다 실제로는 더 쉽게 추출할수 있습니다.

알해보는거야  |  01.07 10:21  

질문자입니다, 다들 답변 감사드립니다.

RNA prep에 문제가 크다는게 공통된 의견이신것 같네요

다시한번 protocol 점검하고 material과 실험기구를 점검하여,  실험을 시도해 보겠습니다.

 

cDNA의 합성량은 kit가 합성할 수 있는 최대량으로 진행해서, 이를 real-time PCR에 사용하고 있습니다.

 

 

asdf  |  01.09 08:44   

보통 cDNA 합성 kit는 RNA 1ug을 필요로 합니다.

 

그리고 같은 연구실에 박사님이 할때는 아무 문제 없다면,

그분께 RNA prep관련해서 한번 봐달라고 하세요.

본인이 인지 못하는 실수가 있을듯 합니다.

멀리서 답을 찾지 마시고 가까운곳에서 찾으세요~

 

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