실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Purification/Isolation
cell에서 RNA prep을 하는데 고질적인 문제가 발생합니다
레벨2 해보는거야 (대학원생)
지금 고질적인 문제로 mRNA expression 확인하는데 문제가 있습니다.
TRIzol을 이용해서 total RNA를 뽑고, 이를 cDNA합성 후에 사용하려고 하는데,
sample을 6~7개 정도 prep을 진행하면, 5ug의 양으로 cDNA를 합성(bioneer kit 사용)하고,
이를 GAPDH PCR을 통해 확인하면, 첨부파일 처럼 전체적으로 균일하게 합성되지 않고,
들쭉날쭉한 결과가 반복되어 나오고 있습니다.
RNA의 농도와 순도는 나쁘지 않은 것 같지만, 항상 어느순간 degradation 되는 것으로 생각됩니다.
그 동안 tip, tube, DEPC water 등 material을 실험마다 새로 써보기 했지만, 완전히 개선되진 않았습니다
심지어, 저희 lab protocol은 TRIzol 사용할 때, RT가 아닌 ice에서 진행하면서 반응시간을 길게 가져 degradation을 더 안되게 하려는 방법을 쓰고 있습니다.
같은 실험실의 박사님은 RNA 뽑을 때, 문제가 없어서 더더욱 저에게서 문제가 발생되는거 같은데
해결할 방법이 보이지 않으니 답답합니다
mRNA level을 확인해야 하는데, cDNA가 준비되지 않으니 실험도 진행되지 못하고 막힌상태입니다.
혹시 RNA prep하시는데 중요한 부분이라던지, 혹시 제가 간과하고 있는 부분이 있으면 도움부탁드립니다
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