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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 point mutation primer 짤 때
알갓오브갓(대학원생)  |  01.05 02:41
첨부파일 파일첨부: 제목 없음.png (49 KB)
이미지 첨부파일

point mutation을 만들고 있습니다.

kit는 사용하지 않고 고전적인 방법으로  4개의 primer를 사용하여 mutation 줄 자리 앞쪽, 뒤쪽을 각각 pcr하여 뜬 다음 두 product를 섞고 overlap하는 식으로 진행하고 있는데요 (구글에서 찾은 모식도를 첨부합니다.)

 

질문 1. mutation primer를 짤 때 염기 3개가 다 다른 것으로 짜도 잘 붙나요?

Leu(CTG) -> Tyr(TAC) 로 mutation을 주고 싶을 때,

예를 들면 ACACAGGC CTG GATCTGC -> ACACAGGC TAC GATCTGC

이런식으로 짜도 잘 붙을까요?

보통 한 두개 염기만 다른 것들로만 해봐서 세 개가 다른건 어떤지 궁금합니다.

 

질문 2. codon optimize 된 염기 3개가 다른 primer

                                           VS

             codon optimize 안된 염기 2 개 다른 primer

  두 가지 중 어느 것이 더 좋을까요?

 

예를 들어 Pro(CCT) 을 Gly으로 바꿀 때, gene에서 주로 쓰이는 Gly(GGA) 가 나은 것인지 아니면 Gly(GGT)가 나은 지 궁금합니다.

codon optimize 와 바뀌는 염기 개수 중 뭐가 더 우선할까요?

 

 

 

 

#PCR
 
#Mutation
 
#overlap
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대왕개구리SPEED  |  01.05 11:08  

1. mutation primer를 짤 때 염기 3개가 다 다른 것으로 짜도 잘 붙나요?

- 3개 염기를 바꿔도 PCR 가능합니다.

2. Pro(CCT) 을 Gly으로 바꿀 때, gene에서 주로 쓰이는 Gly(GGA) 가 나은 것인지

아니면 Gly(GGT)가 나은 지 궁금합니다.

codon optimize 와 바뀌는 염기 개수 중 뭐가 더 우선할까요?

- 염기를 바꾸는 이유가 codon optimize라면 gene 내부에서 사용 빈도가 높은

codon으로 바꾸는 것이 좋고 염기 갯수는 고려 사항이 아닙니다.

대왕개구리강시  |  01.05 13:12  

mutation시티려고 치환시키는 염기의 3' 쪽으로 8 염기 정도는 길게 디자인하세요.

 

ACACAGGC CTG GATCTGC -> ACACAGGC TAC GATCTGC

 

이 염기치환에서는 3' 쪽으로 6 염기정도 떨어졌는데, 이런 경우 PCR이 안될 수 있습니다.

왜냐하면 DNA ploymerase가 DNA에 결합해서 이동할때 polymerase와 결합한 DNA 부분은 염기서열이 완전히 상보적으로 결합해야 polymerase가 합성을 합니다.

polymerase가 결합한 DNA 부분이 완전히 상보적이지 않으면 DNA 이중나선이 틀어져 있어서 mismatching으로 인지하게 됩니다. 그러면 polymerase의 proofreading이 되서 micmatching된 부분까지 polymerase가 후진하면서 mutation시킨 염기를 제거하고 새로 정확한 염기를 넣으면서 합성합니다. 

그래서 PCR이 되도 mutation이 들어가지 않은 PCR product가 만들어지죠.

Pfu 같은 경우 아런 현상이 더욱 심합니다.

Taq DNA pol도 치환시킨 염기가 3' 쪽에 너무 가까이 있으면 합성을 안합니다.

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