얼마나 많은 조건을 검토 했는지 모르겠지만 PCR에서 target band가 안보이면
PCR 조건을 먼저 검토해 보고 그래도 안나오면 primer를 바꿔보세요.
그리도 안보이면 template에 있는 다른 유전자를 대상으로 PCR해서
band가 잘나오는지 확인해 보세요.
현재 gDNA에서 다른 gene의 증폭은 잘되고 target gene은 잘 안되면 target gene이
현재 gDNA에 있는지 database를 한번 더 확인해 보세요.
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레벨5
CHINyo76_philekorea
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20.01.03 08:40
어떤 종의 gDNA인지 PCR product의 length가 어떻게 되는지 알려주시면 답변에 도움이 될텐데 아쉽네요.
일반적으로 target band는 증폭되지 않고 잡밴드만 많이 잡힌다는 것은 PCR primer의 서열 확인부터 진행하시고, 문제가 없다고 판단되면 PCR 조건을 잡으셔야 합니다. 혹시 extension time이 짧은 것은 아닌지도 확인해 보시고, annealing temp.를 증가시켜 볼 수 있습니다.
그리고 가용한 polymerase가 있으면 몇가지를 가지고 비교해 보시는 것도 필요할 수 있습니다. target region의 조건에 따라 PCR이 원활하지 않은 경우도 있으니까요.
마지막으로 다시 primer set를 잘 design하셔서 진행할 수 있습니다.
PCR이 항상 100% 원하는 밴드가 나오면 좋겠지만 경우에 따라 어려운 경우도 많습니다.
좋은 결과 있으시길 바라며 자세한 내용으로 글을 올려주시면 좀 더 구체적인 답변이 가능할 것 같습니다.
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레벨6
Applied_Microbe
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20.01.03 09:22
원래 PCR 잘 되던게 안되는건가요?
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레벨2
BDan
(대학생)
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20.01.03 15:10
gene engineering을 하였고, 원하는 위치에 제대로 들어갔는지를 확인하는 것이 목적인 PCR입니다..
일단 vector가 들어간 것은 확인하였으나, 원하는 위치에 들어갔는지가 의문입니다. 계속 PCR 결과가 안나오거든요..
PCR 조건 자체에는 문제가 될만한 것이 없고,
annealing temperature는 gradient를 줘서 충분히 다 확인을 해봅니다.
의심이 될만한 건 primer와 gDNA인데 primer set를 아무리 바꿔도 안나온다는게 문제예요 ㅠㅠ
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레벨6
Applied_Microbe
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20.01.03 17:43
shuttle vector에 넣고 숙주내로 넣어서 mutation 을 유도하는건가요?
primer site가 vector에 있던 insert DNA에 있던 .... 어느정도 양이 있으면 PCR band가 나타날텐데 ..... 해당 band는 없고 다른 불특정 band만 보인다면
..... Contamination 보다는.... 그 DNA 가 없는것 같은데요...
Vector는 확인되는데 Insert DNA가 확인이 안되는것인가요?
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레벨2
BDan
(대학생)
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20.01.03 18:06
insertion은 확인하였으나, 어느 곳에 들어갔는지 모릅니다..
때문에 서던블랏을 해보려고 하지만, 가지고 있는 gDNA 농도가 충분치 않아 일단 최대한 PCR로 확인을 해보려 했습니다.
원하는 위치에 들어갔다고 감안하고 primer를 짜서 증폭시켰지만, 안되나봅니당..
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레벨6
Applied_Microbe
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20.01.03 19:01
어디까지나 제 생각인데요.......
Insert DNA의 사이즈가 작고, 숙주의 gDNA sequence를 안다면 아래 방법으로 교차 염기서열분석해보는건 어떨까요
마크로젠에서도 16s rRNA 염기서열 분석할때 785F와 907R 로 분석하더라고요
대충 800bp 정도는 읽을 수 있으니 Insert DNA size의 사이즈가 작다면 위치 추정이 가능하지 않을까요?