실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
Protein SDS-PAGE를 진행했는데요.
레벨1 94년생미필백수 (대학원생)
protein SDS-PAGE를 진행하였는데,
어느 순간부터인가 sample의 loading이 일어나지 않습니다.
평소와 동일하게 잘 SDS-PAGE를 진행하고 있었는데요
어느날부터인가 첫번째 사진처럼 marker만 내려가고 band가 관찰되지 않는 현상이 일어났습니다.
혹시 loading buffer의 문제일까 싶어 loading buffer를 다시 만들어도보고
gel을 만들 때 쓰는 solution도 새로 만들어서 사용해보았습니다.
혹시 그리고 기계에 문제가 있어서 좌측 well에 넣은 것만 loading이 일어나고 우측 well은 일어나지 않는가도 싶어서 마커를 두 군데에 나누어서 넣어 보았는데 마커도 잘 내려가는 것이 확인되었습니다.(마커가 조금 휜 것은 gel을 만들 때 gel이 울퉁불퉁하게 제작된 것 때문인 것 같습니다.)
그래서 혹시 제가 만든 protein purification등이 잘못 된 것인가 싶어 동료의 purified enzyme을 받아 gel을 내려보았는데 마지막 사진처럼 역시 band가 우측 위에 생성되네요.
이런 경우, 무엇이 문제일까요? 제가 마지막으로 의심하고 있는 것은
1. b-mercaptoethanol이 상태가 안 좋아져(상해서 환원성을 잃거나 등) 단백질을 1차 구조로 제대로 풀지 못했거나
2. loading buffer 제작시 pH를 맞출 때 사용된 Cl-의 양이나 glycine양이 잘못되어 protein이 내려가지 못하고 있다.
인데, 2번은 사실상 sds-page가 잘 이루어지던 버퍼였다가 어느 날 부터인가 갑자기 band가 내려가지 않는 것을 보니 1번 문제일 가능성이 크다고 생각합니다.
원래 이렇게 밴드가 나와야 정상입니다. ㅠㅠ
여러분들의 생각은 어떠신가요? 조언 구합니다 ㅠㅠ
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