1) 위 3kb이상에서 band는 gDNA가 맞는지? 또는 gDNA가 아닌 다른 물질일
수도 있을 까요?
: 제일 위에 있는 것이 gDNA입니다.
왼쪽에서 1, 2lane은 gDNA가 보이고 3, 4lane은 안보이네요.
2) sample이 동결건조 분말 형태입니다.
(동결건조된 sample은 상관없다고 했는데 분말형태가 걱정됩니다.)
따라서 sample의 문제가 있을 수 있을까요? (DNA가 온전한지 및 변성)
: 1, 2lane에 추출된 상태를보니 별 문제는 없을 것 같습니다.
3) 대부분 식물에서 gDNA 추출 시 이파리나 줄기로 하던데 저희는 열매로
진행하고 있습니다.
gDNA 추출 시 다당류같이 이차 대사산물이 있어 많이 수율이 낮을 까요?
: 열매도 관계가 없고 식물에서 gDNA 추출은 다른 세포보다 조금
까다롭습니다.
- method는 CTAB manual로 진행하였습니다. (Keb-Llanes et al. 2002)
: CTAB를 사용해야지 추출이 용이합니다.
- 먼저 protocol이나 시약에는 문제가 없을 것 같은데
: 실험protocol은 보지 못해서 문제가 있는지 없는지는 모르겠네요.
CTAB 방법도 여러 종류가 있습니다.
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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19.12.24 11:12
빠른 답변 감사드립니다.
추가적으로 혹시 저 2kb의 band는 gDNA가 잘려나온 것 일까요? 아니면 다른 물질일까요?
RNase는 가장 마지막에 TE buffer로 suspension 할 때에 처리하였습니다.
감사합니다.
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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19.12.24 11:18
혹시 method에 문제나 주의할 점이 있는지 protocol 첨부합니다.
실험에서는 protocol대로 그대로 진행했습니다.
감사합니다.
아래에 나온것은 RNA는 아닙니다.
DNA일것으로 보이는데 확실하지는 않습니다.
우선 gDNA 분리가 정상적으로 되고 나서 확인해 보면 좋을 것 같습니다.
protocol은 별로 좋지 않은 방법으로 보입니다.
- CTAB 용액은 1액으로 된 방법이 있습니다.
- lysis buffer를 넣고 멸균 bead로 1차 파쇄 후 65도에서 최소 30분 이상
incubation 하는 것이 좋고 10분에 3-4회씩 inverting하는 것이 좋습니다.
- CTAB 처리 시료는 phenol extraction을 하는 것이 좋습니다.
첨부된 protocol 아래의 전기영동 사진을 보면 gDNA가 거의 추출이 안된것을
볼수 있습니다.
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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19.12.24 14:03
빠른 답변 감사합니다.
아하 다른 프로토콜을 참고해 보겠습니다.
추가적으로 CTAB buffer 1액이라 하셨는데
본 protocol에서 extraction buffer A, B 및 20% SDS처럼 3가지 말고 1가지의 CTAB buffer로만 되어있는 protocol 참고하라는 말씀이신가요?
좋은 하루 되세요:)
젤 사진이나 첨부하신 프로토콜에서 추리해보면, 결정적으로 Lysis가 부족하게 되었습니다. 버퍼와 시간이 다 문제예요.
그 프로토콜은 CTAB과 SDS를 혼합해서 사용하고 있는데, 둘 중 하나만 골라서 사용하는 것이 좋습니다. 이쪽 분야에서 대부분은 Doyle&Doyle의 CTAB 방법(1987, 1991)을 사용하는데, 다양한 변형들이 있지만 원전보다 나은 방법이 드뭅니다. 제시하신 프로토콜도 그런 변용 중의 하나이지만, 방법의 번거로움에 비해 결과의 일관성이 부족한 듯 합니다. Original protocol은 구글에서 뒤져보면 많이 나와 있습니다.
CTAB 추출법에서 Lysis 시간을 늘리면 간단하게 효율이 높아집니다. 대개의 프로토콜은 30분에서 1시간을 제시하고 있지만, 충분한 양의 beta-mercaptoethanol(0.5%정도?)을 첨가하고, 하룻밤을 60도에 처리하는 것만으로도 수율과 품질이 획기적으로 올라갑니다. 특히 건조 시료인 경우는 fresh leaf와 달리 분해가 더디기 때문에 overnight digestion이 더 좋습니다.
중간의 밴드는 아마 엽록체 DNA일 것 같지만, 무시하고 genomic DNA 수율을 높이는데 집중하세요.
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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19.12.27 12:45
답변해주신분들 감사드립니다.
lysis시간을 늘리니 band도 명확해지는 거 같습니다.
3, 4lane은 sample에 문제가 있는지 나타나질 않네요ㅠㅠ
감사합니다 :)