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질문 ion-exchange chromatography.. 방법을 잘 모르겠어요.
알키린(대학원생)  |  2019.12.18 23:28

 

안녕하세요 

제가 ion-exchange chromatography를 하려고합니다. 

배양상등액에서 원하는 물질의 HPLC 분석을 위해서 인데요. 

제가 사용하는 resin은 amberlite IR120 resin (H+form), dowex 1x2 resin (OH-form)이 두개만 사용하거나 Amberlite CG-50(NH3+ form)까지 사용하기도 합니다. (reference 참고) 

헌데 전혀 chromatography에 관한 지식이 없다보니 충진하는 방법부터 elution하는 볼륨까지 전혀 감이 안잡힙니다. 제일 궁금한건 충진하는 방법입니다. 

저는 일단 테스트용으로 주사기에 솜 넣고 IR 120 resin을 물로 씻어준 후 물과함께 흘려보내며 충진합니다. 그 후 제 샘플을 로딩하고 물로 여러번 세척해줍니다. (이때 제 샘플이 배지가 많이 농축되어서 갈색인데 갈색이 나오지 않을정도로 씻어줍니다.) 이후 Ammonium hydroxide로 elution해주는데 언제까지 해줘야할지 몰라서 또 색이 없어질때까지 여러 fraction을 받았습니다. 

이 때 물로 여러번 세척한 fraction과 Ammonium hydroxide로 elution한 fraction은 중간에 효소저해활성방법으로 측정해보았는데 물로 세척해서 처음 나온 fraction에서 저해활성이 측정되었고 (없을것으로 예상했지만) 

Ammonium hydroxide으로 elution한 fraction은 Ammonium hydroxide에서 전혀 assay가 측정되지 않았습니다. - 논문에 보면 그냥 농축해서 OH- form column에 loading 합니다.- 

근데 농축해서 OH- form column에 loading하고 dw로 elution하는데 fraction에서 효소저해 활성이 없습니다. 제 생각으로는 OH- form resin 충진이 잘 안된건 아닌가 싶거든요.. 

그냥 시약수저로 퍼서 넣었어요. 물로 씻어주고 충진하면 안될거같아서요. 

그랬더니 약간 갈색의 loading 한 흔적이 나오지 않는걸 보니 elution이 안되는거같은데... 지금 전혀 감이안잡힙니다. 

도대체 resin 충진은 어떻게 해야하나요....?? 

제 샘플은 농축이 1/10정도 된 상태인데 약간의 점성이 있는 찐득한 상태이구요 물에 쉽게 풀어집니다. (1ml 정도의 양으로 test 중입니다) 

두서없는 글 읽어주셔서 감사합니다. 

혹시나 도움주실분 계시면 감사하겠습니다. 

#chromatography
 
#충진
 
#column
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.12.18   

질문을 읽어 보니 IEX에 대한 지식이 전혀 없네요.

resin 평형화, 시료 평형화가 전혀 안된상태입니다.

따라서 정제가 될수 없는 조건입니다.

우선 정제하고자하는 단백질의 pI(등전점)과 분자량은 얼마인가요?

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