1. gradient gel을 만들면 한 gel에서 볼수 있습니다.
1-1. gradient gel로 한 blot에서 3개 다 잡으시면 loading cont. 는 b-actin 하나만 하셔도 될것같습니다.
1-2 loading cont.는 target 잡은 동일 blot에서 확인하는 것이 맞을 것 같네요. 52kda의 target 잡으신 후에 stripping 하고 b-action 잡으세요.
2. 저는 보통 loading dye 빠져나가기 직전까지 내리는데, 원하는 protein size가 gel에 남아있을 만큼 내리면 됩니다.
3. 저의 경우에는 한번에 한 종류의 target만 잡습니다. 아주 깨끗하게 target protein 위치에만 band가 나오는 경우도 있지만, polyclonal Ab 사용하거나 하면 non speicific band도 같이 나오기 때문에, 동시에 여러 target을 잡는 것은 선호하지 않습니다. 만약 florescence 달린 secondary Ab로 확인하신다면 두 target을 각각 다른 florescence 로 detection 하는 방법은 좋겠네요. 개인적으로 b-actin은 아주 잘 잡히기 때문에 stripping이 완벽하게 되지 않을 수있고 LAS image 얻을 시에 membrane이 타는 경우도 있어서 target protein 다 잡고나서 마지막에 잡습니다.
4. 저는 주로 5분씩 3회 하는데 큰 문제는 없습니다. 길수록 더 washing이 잘 되긴 하겠지요.
5. 전 주로 PVDF를 사용하여서 NC의 경우는 잘 모르겠습니다.
6. 저는 그냥 티슈에 membrane 한쪽 모서리 대고 어느정도 물기 빠지면 바로 ECL 칩니다.
7. protein이 많으면 빨리 발색되고 protein이 적으면 늦게 발색이 되겠지요.
8. running buffer는 재사용하지 않는 것이 좋습니다. 큰 size protein 확인할 시엔 size차를 많이 벌리기 위해서 running을 오래하는 경우도 있는데, 이때 작은 size의 protein들이 running buffer로 빠져나가기 때문에 재사용시에 다음 실험에 영향을 줄 수있습니다. transfer buffer의 경우에는 methanol이 증발되어 조성이 변경될 수있어 재사용하지 않는것이 좋겠네요.
9. 3회정도까진 재사용 해봤습니다.
10. 어느 것이 더 좋을진 모르겠지만 저는 주로 room temp.에 1 h incubation하고, 재사용안합니다.
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레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
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19.12.18 09:11
답변 정말 감사합니다!!!
1. gradient gel 만드는 법을 찾아봤는데...어려울 것 같아서요.. gradient gel을 사용하지 않을 경우에는 어떻게 하는게 좋을까요??
2. 혹시 제 3번 질문에 대해 다시 한번 답해주실 수 있으신가요..? 한번에 한 종류에 target만 잡으신다는 것은 loading cont. 이 아닌 다른 단백질을 말씀하시는 거죠?? 결국 target하는 거 하나와 loading cont. 하나, 총 두개를 한번에 처리하신다는 말씀인건가요..? 아니면 한 membrane에 target이든 loading cont. 이든 하나만 처리하신다는 말씀이신가요? loading cont.은 동량을 로딩했는지, 보정하는 개념이라 전자처럼 한번에 해야하는게 맞는거죠?
3. transfer 할 때 mA와 시간은 어떻게 설정하시나요? 너무 길 경우에는 빠져버릴 수 있다고 해서요..100V에서 1시간~1시간 30분 정도 하면 적당한가요?
모든 실험은 진행 전에 충분히 방법을 검토해 보는 것이 상당히 중요하지만
실제 해당 lab에서 해보고 조건을 잡아야 하는 실험도 많습니다.
1. gradient gel 만드는 법을 찾아봤는데...어려울 것 같아서요.. gradient gel을
사용하지 않을 경우에는 어떻게 하는게 좋을까요??
: 예전에 실험할 때는 gradient gel을 항상 만들어 사용했는데 요즘에는 판매하는
업체가 많아서 구매해서 사용하면 됩니다.
2. 한개의 시료에서 여러개의 taget을 detection하는 방법은 여러가지가 있습니다.
1장의 gel에서 여러개를 detection하는 방법, 1gel에 1개만 detection하는 방법 등..
여러개를 detection할때도 순차적으로 detection하는 방법, 여러개를 동시에
detection하는 방법 등..
3. transfer 할 때 mA와 시간은 어떻게 설정하시나요? 너무 길 경우에는
빠져버릴 수 있다고 해서요..100V에서 1시간~1시간 30분 정도 하면 적당한
가요?
: 100V 기준으로 gel%에 따라 약간씩 다르지만 2시간을 넘지않습니다.
이 경우도 해당 lab에서 몇번 해보고 최적 시간을 잡는 것이 필요합니다.
1-2 52와 b-actin(43정도)은 거의 차이가 없는 것 같은데...한번에 구별 가능한
가요? 아니면 gel을 따로 만들어 로딩해야 할까요?
: 2장의 gel에서 target과 reference를 각각 detection하면 reference 의미가 없습
니다.
한장의 gel에서 target → reference 순차적으로 detection 하면 됩니다.
아니면 10% gel에서 항체만 좋으면 52, 43충분히 한번에 detection됩니다.
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레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
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19.12.18 18:25
답변 감사합니다!!
target -> reference 순으로 detection 하라는 말씀은 스트리핑을 말씀하시는 게 맞나요??
네.. stripping 해서 하면 되고 그 정도 분자량 차이면 membrane을 잘라서
target과 reference를 각각 보면 됩니다.
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레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
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19.12.18 22:48
답변 감사합니다! 혹시 멤브레인 자를 때 팁이 있을까요..? 양쪽 끝 lane에 마커걸고 가위로 최대한 잘 잘르면 되나요..?
전기영동 skill이 항상 수평으로 잘 내려가게 할수 있으면 한쪽만 걸어도 되고
불안하면 양쪽에 걸어도 됩니다.