실험 Q&A Cell Biology > Cell Culture
tissue dissociation 질문드립니다.
레벨1 alswl1207 (과기인)
안녕하세요
single cell 분리를 위한 tissue dissociation 과정중 막히는 부분이 있어서 질문 올립니다.
mouse 조직인데 좀 질겨요. collagen, fibril 성분들이 많아서 잘게 자른 후 0.2% collagenase를 이용하여 중간중간 pipetting을 해가며 1시간 정도 incubation을 합니다.
그래야 그나마 조직이 흐물흐물 해지고, syringe를 사용하여 흐물거리는 틈 사이에 껴있는 세포들을 빠져나오게 하고 있어요.
어느정도 됐다 싶어 40 um stainer로 걸러서 워싱해주고 스핀을 돌리면 다운되지 않고 다 상등액에 남아있어요.
첨엔 확인 안하고 상등액을 버렸더니 남아있는 세포가 없더라구요;;
스핀은 처음엔 1500rpm 5min으로 해서 실패, 2000rpm 5min, 10min으로 해서 실패, 3000rpm 5min도 실패, 어디한번 죽어보자 하고 3000rpm 15min도 해 보았지만 다 상등액에 세포가 남아있어요.
이정도면 죽은세포들도 가라앉지 않나요?
제가 생각하기로는 분해된 섬유질들이 세포들을 잡고 가라앉지 못하게 하는거 같은데...실험실 분은 세포가 죽어서 안가라앉는거 아니냐고 하고요.
상등액을 확인해본결과 많은 single cell들이 둥둥 떠다니고 있어요 ㅠㅠ
pellet들은 찌꺼기 같은것만 가라앉아있고요.
정말 죽어서 안 가라앉는 걸까요? enzyme 농도를 낮춰서 해볼까요?
둥둥 떠있는 세포를 손상없이 가라앉히려면 최대 몇 rpm, 몇 min까지 가능할까요?
고수님들의 조언 부탁드립니다 ㅠㅠ
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