실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
단백질 정제 관련 질문드립니다ㅠㅠ
레벨2 유니지 (대학생)
안녕하세요 생화학 실험을 하고 있는 학부생입니다.
질문
1) 로딩 후의 wash에서는 A-buffer만 넣어줬기 때문에 6번에서는 band가 관찰되지 않아야 한다고 생각하는데 왜 band가 나왔는지 모르겠습니다.ㅠㅠ 그 이유가 뭔지 가르쳐주세요ㅠㅠ
2) 아래의 page사진에서 total, insoluble,soluble이 있는데요 그거는 세포파쇄후의 용액을 centrifuge하기전에 전체로 모은 total용액과, centrifuge후 pellet부분만 가지고 만든 insoluble, supernatant부분만 가지고 만든 soluble sample용액을 같이 page내린 결과입니다. 저기서 mark의 10kDa밴드 밑으로 insoluble, total sample에서만 밴드가 관찰되어서 그부분이 EGF같은데 20kDa 마커밴드 위치부분에 soluble과 total sample에서 발견된것은 fusionpartner가 붙은 EGF(분자량 23kDa)인건지 아니면 그냥 세포에 있던 다른 단백질인 건지 궁금합니다.
실험내용!
단백질 정제 실험을 하고 있는데요. E.coli에서 EGF 단백질을 정제해내기 위한 실험입니다.
실험을 하면서 이온교환 크로마토그래피를 진행하였는데 Wash-Loading-Wash-Elution-wash순으로 진행하였습니다.
Q-resin이 관에 3cm정도 들어있었고, A-buffer는 20mM Glycine(pH 9.0)을 사용하였고, B-buffer는 20mM Glycine(pH 9.0) + 1M NaCl 을 사용하였습니다.
wash과정은 로딩 전, 로딩 후, elution 후 모두 A-buffer를 3ml씩 넣어주었고, loading도 샘플(정제해야할 단백질용액)을 3ml 넣어주었고, elution과정은 B-buffer에 gradient를 주지않고 1M 의 NaCl농도 그대로를 6ml 넣어주었습니다. (저희가 실험을 진행할때 gradient를 주어야 하는지 몰랐습니다ㅠㅠ) 각 실험과정마다 용액을 레진에서 2cm씩 남겨두고 다음 용액들을 넣어주었는데 좀 많이 남겨둔것같습니다ㅠ 각 과정마다 1ml씩 나눠서 용액들을 받아두었습니다.
위의 방법으로 크로마토그래피를 진행한 결과를 가지고 sds page를 내린 결과입니다. ㅠㅠ 알고보니 저희가 로딩할때 넣어줬던 단백질 용액은 순수한 egf만 들어있던 용액이었습니다.
1번은 로딩전 워시과정이고, 6번은 로딩후 워시 과정이며, 9번은 Elution 6ml 중 2ml째 받을 때의 용액이고, 10번은 Elution 6ml 중 3ml째 받을 때의 용액, 11번은 Elution 6ml 중 4ml째 받을 때의 용액, 14번은 마지막 워시 과정의 용액입니다.
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