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질문 단백질 정제 관련 질문드립니다ㅠㅠ
올챙이유니지(대학생)  | 2019.12.13 23:10
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안녕하세요  생화학 실험을 하고 있는 학부생입니다.

질문

1) 로딩 후의 wash에서는 A-buffer만 넣어줬기 때문에 6번에서는 band가 관찰되지 않아야 한다고 생각하는데 왜 band가 나왔는지 모르겠습니다.ㅠㅠ 그 이유가 뭔지 가르쳐주세요ㅠㅠ

2) 아래의 page사진에서 total, insoluble,soluble이 있는데요 그거는 세포파쇄후의 용액을 centrifuge하기전에 전체로 모은 total용액과, centrifuge후 pellet부분만 가지고 만든 insoluble, supernatant부분만 가지고 만든 soluble sample용액을 같이 page내린 결과입니다. 저기서 mark의 10kDa밴드 밑으로 insoluble, total sample에서만 밴드가 관찰되어서 그부분이 EGF같은데 20kDa 마커밴드 위치부분에 soluble과 total sample에서 발견된것은 fusionpartner가 붙은 EGF(분자량 23kDa)인건지 아니면 그냥 세포에 있던 다른 단백질인 건지 궁금합니다.

실험내용!

단백질 정제 실험을 하고 있는데요. E.coli에서 EGF 단백질을 정제해내기 위한 실험입니다.

실험을 하면서 이온교환 크로마토그래피를 진행하였는데 Wash-Loading-Wash-Elution-wash순으로 진행하였습니다.

Q-resin이 관에  3cm정도 들어있었고, A-buffer는 20mM Glycine(pH 9.0)을 사용하였고,  B-buffer는 20mM Glycine(pH 9.0) + 1M NaCl 을 사용하였습니다.

wash과정은 로딩 전, 로딩 후, elution 후 모두 A-buffer를 3ml씩 넣어주었고, loading도 샘플(정제해야할 단백질용액)을 3ml 넣어주었고, elution과정은 B-buffer에 gradient를 주지않고 1M 의 NaCl농도 그대로를 6ml 넣어주었습니다. (저희가 실험을 진행할때 gradient를 주어야 하는지 몰랐습니다ㅠㅠ) 각 실험과정마다 용액을 레진에서 2cm씩 남겨두고 다음 용액들을 넣어주었는데 좀 많이 남겨둔것같습니다ㅠ 각 과정마다 1ml씩 나눠서 용액들을 받아두었습니다.

upload_image     upload_image

위의 방법으로 크로마토그래피를 진행한 결과를 가지고 sds page를 내린 결과입니다. ㅠㅠ  알고보니 저희가 로딩할때 넣어줬던 단백질 용액은 순수한 egf만 들어있던 용액이었습니다.

1번은 로딩전 워시과정이고, 6번은 로딩후 워시 과정이며, 9번은 Elution 6ml 2ml째 받을 때의 용액이고, 10번은 Elution 6ml 중 3ml째 받을 때의 용액, 11번은 Elution 6ml 중 4ml째 받을 때의 용액, 14번은 마지막 워시 과정의 용액입니다.

 

 

#단백질정제
 
#이온교환크로마토그래피
 
#EGF
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.12.13   

1. 발현 vector의 fusion partner는 어떤걸 사용했나요?

2. mono-Q에 loading한 단백질 총량은몇 mg인가요?

3. mono-Q resin은 어떤 방법으로 평형화 시켰나요?

4. wash buffer는 어떤걸 사용했고 washing fraction은 몇 ml씩 총 몇개를 받았나요?

올챙이유니지  |  2019.12.13   

1. 발현 vector의 fusion partner는 어떤걸 사용했나요?

fusion partner는 ARSNTD를 사용했습니다.

 

2. mono-Q에 loading한 단백질 총량은몇 mg인가요?

저희가 조교님께 받은 단백질 용액을 로딩한 것이어서 정확히 용액안에 몇미리가 있었는지는 듣지 못했습니다ㅠㅠ 그렇지만 3ml 로딩하였고, 나중에 흡광도를 측정해서 (브래드포드법으로) 정량한 값이 3ml안에 약 3.66mg들어있는것으로 계산되었습니다.

3. mono-Q resin은 어떤 방법으로 평형화 시켰나요?

평형화 시킨 방법이 뭔지는 정확히 모르겠으나, 저희는 빈 column에다 에탄올에 넣은 레진(하얀가루처럼 되어있었음)을 넣어서 레진을 가라앉혀주었습니다.

실험때는 이미 레진이 관에 들어있었어서 그것을 사용하였습니다. Q resin이 3cm 충전되어있었습니다.

4. wash buffer는 어떤걸 사용했고 washing fraction은 몇 ml씩 총 몇개를 받았나요? wash beffer는 A-buffer를 사용했으며, A-buffer는 20mM Glycine(pH 9.0)이었습니다. 로딩전, 로딩후, elution후 마지막 wash과정 모두 3ml씩 넣어주었습니다.

wash buffer를 넣어준뒤에 3ml를 1ml씩 나눠서 받았습니다ㅠ

 

대왕개구리SPEED  |  2019.12.14   

1.  ARSNTD는 사용해본적이 없는데 분자량과 어떤 vector를 사용했나요?

2. 이온교환 정제에서 washing단계에 목적 단백질이 나오는 경우는

- loading 단백질 총량이 resin binding cap.를 초과한 경우

: 3.66mg은 3ml mono-Q에 충분히 붙는 양입니다.

- 목적 단백질이 resin에 붙지 않는 조건일 경우

- pH9에서 EGF는 (-) charge이기 때문에 mono-Q에 잘 붙습니다.

fusion과 붙어 있어도 pH9에서는 전체단백질이 (-)charge를 가질겁니다.

- 사용 resin의 평형화가 잘 되지 않은 경우

: 이온 resin의 평형화는 목적 단백질을 붙이기 위해 charge를 만드는 과정

입니다.

충분히 평형화가 되지 않은 경우 목적 단백질이 잘 붙지 않습니다.

loading단백질도 충분하고 pH도 괜찮기 때문에 resin 평형화를 음이온 교환수지

방법으로 하지 않은것 같습니다.

resin을 컬럼에 채우고 buffer로 흘려 준다고 평형화가 되는 것은 아닙니다.

그리고 20K 부근에나온 단백질은 fusion 단백질이 붙어 있다면 10K 부근이

EGF band이지만 20K 부근 단백질이 실제 발현 단백질일 것이고 2 band로

나눠진 것은 fusion 단백질이 뭔지 알아야 원인을 알수 있을 것 같습니다.

 

올챙이유니지  |  2019.12.14   
우선 fusionpartner 로는 ARSNTD가 사용되었고 ARSNTD가 EGF와 D4K로 연결되어있다고 들었습니다. 그리고 배양시킬때 IPTG를 넣어주어서 과발현시킨다고 하셨구요 FUSION 단백질은 ARSNTD입니다.
resin평형화는 어떻게 시켰는지 몰라서요ㅠㅠ
이미 평형화 되어있는 resin을 사용했는데 중간에 저희가 크로마토그래피를 진행하면서 그 평형화가 잘못될 가능성도 있나요???
대왕개구리SPEED  |  2019.12.14   

평형화된 resin은 sample을 붙이기 위한 과정이기 때문에 붙이고 나면

이후에는 평형화 개념이 적용되지 않습니다.

현재까지 정보- loading양, pH-로는 resin 평형화 문제로 washing 단계에서 나온것

같습니다.

보통 이온교환 정제 할때는 washing 단계에서 받은 fraction을 일부 전기영동

해보고 결과가 예상밖이면 모든 washing 단계의 fraction을 전기영동 해서

안붙은 단백질을 확인 합니다.

올챙이유니지  |  2019.12.14   

아아 알겠습니다! 답변해 주셔서 감사드립니다ㅠㅠ

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