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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western actin 밴드는 보이는데 타킷 밴드가 안보여요
올챙이빌루(대학생)  | 2019.12.13 13:56
질문 그대로 western을 진행중입니다.
원래 잘 보이던 타깃 밴드가 갑자기 전혀 안보이는데, 이상하게 actin은 보여요
ponsue S에서도 타깃 밴드는 보이지 않고 actin은 보이는게 로딩 문제 같은데 의심가는 부분은 tank buffer를4번째 재사용중이었다는 겁니다. 잦은 재사용으로 버퍼의 ph가 변해서 그런건지..
혹시 다른분들은 tank buffer 몇 번 까지 재사용 해보셨나요?
#western
 
#band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.12.13   

전 가끔씩 트랜스퍼 버퍼는 2번 쓰네요...
이것도 매번 프레쉬하게 만들려고 노력은 하지만 가끔씩 2번 쓸때도 있는것입니다...

트랜스퍼버퍼는 일단 1회 사용이 맞습니다.

뒷다리영빙구  |  2019.12.13   

1. 타겟밴드와 actin이 다른 gel 에 있다면

transfer buffer의 문제이거나 타겟이 발현이 안 된 것일수도 있어요

2. 타겟밴드와 actin이 같은 gel에 있다면

transfer buffer에 문제가 없을가능성이 큽니다. 만약 문제가 있다면 actin도 안나오는게 맞는거죠

 

추가로 저 같은 경우에는 transfer buffer는 한번쓰고 잘 안썼던 걸로 기억합니다.

대왕개구리SPEED  |  2019.12.13   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

전기영동 buffer, transfer buffer는 1회 사용이 원칙입니다.

편의상 몇번씩 사용하는 경우도 있는것 같습니다.

ponseu S는 CBB보다 감도가 낮은 염색 dye입니다.

따라서 ponseu S 염색에서 눈에 안보인다고 단백질이 없는것은 아니고

원하는 위치에 band가 있어도 목적 band 외에 여러 band가 있는 경우도 있고

다른 band는 있는데 목적 band만 없는 경우도 있습니다.

1D 전기영동에서 1 band = 1 protein이면 2D 전기영동 분석을 할 필요가

없을겁니다.

잘 나왔던 시료라고 했으니까 Ab 쪽을 한번 점검해보는 것은 어떨까요?

 

KKAKKA  |  2019.12.13    

 

기존에 타겟 밴드를 봤던 sample이 남아있나요?

같은 sample로 실험을 진행하는데 band가 나오지 않는다면 sample 문제일 수도 있을 것 같습니다.

sample을 boiling 하여 보관해도 가끔 그런 경우가 있더군요.

같은 sample이 아니라 새로 만든 sample이라면 세포 배양 단계부터 의심해보세요.

의외로 전기영동 및 blotting 과정엔 문제가 없는 경우가 많아요.

올챙이빌루  |  2019.12.13   
답변해주신분들 모두 감사드립니다. 저는 조직에서 sample을 얻어 세포배양과는 관계가 없고, Ab도 기존에 나왔던 거라..혹시 제가 Santa cruz제품을 사용하고있는데 기존에 나왔던 Ab가 추천 방법으로 보관했을경우에도 변성될 가능성이 있나요? 그리고 저는 transfer buffer는 재사용하지 않고 전기영동buffer인 tank buffer를 재사용했습니다ㅠ 이게 문제가 될까요?
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