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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 genomic DNA의 Tm 값 구하는데 도와주세요ㅠ
알이지지지짛(과기인)  | 2019.12.12 15:59

논문을 찾아보다 보니 

genomic DNA의 Tm 값을

real time PCR로 melt curve를 이용해서 구하더라구요

논문에 나온대로 70도에서 15초 이후  70도에서 98도로 초당 0.1도 증가 

로 세팅하여 pcr 수행했습니다. 

논문에서는 SYBR green 1 을 4000X 혹은 10000X로 사용하라고 했는데

실험실에는 SYBR green master mix만 있어서 이걸 사용했습니다. 

예상으로는 각 샘플당 meling curve가 깨끗하게 나오고 Tm값을 구할수 있을거라고 생각했는데, multi peak가 존재하여 Tm 값을 구할수가 없었습니다. 

 

genomic DNA 의 Tm 값을 구할때 어떻게 하셨는지 궁금합니다. 

 

#Tm
 
#DNA
 
#real time PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리CHINyo76_philekorea  |  2019.12.13   

melting curve 그래프를 같이 올려주셨으면 더 좋을텐데 아쉽네요.

먼저 melting curve로부터 multi peak가 존재하여 Tm 값을 얻을 수 없었다고 하셨는데, 일단 curve가 확인되었다면 sybr green 1의 농도문제는 어느정도 접을 수 있다고 생각됩니다. 

genomic DNA를 PCR amplification 후에 melting curve를 확인하셨다면,

몇가지 이유가 있을 수 있습니다.

첫번째로 가끔 저도 그런 경험이 있었으나 나타나는 부분이 primer dimer로서 이 경우 cycle 수를 25 - 30이내로 하여 어느정도 줄일 수 있었습니다.

두번째는 genomic DNA가 작게 break되어 있는 경우도 있습니다. 이 경우는 template DNA를 전기영동으로 확이하시면 판단가능 하실겁니다.

세번째는 primer design의 문제가 있을 수 있습니다. dimer와 조금 다른 이야기 인데 확률은 적으나 아무래도 genomic DNA이다보니 homologus가 높은 non-target DNA sequence 부위에서 non-specific PCR 반응이 일어나는 경우가 있을 수 있습니다. 

마지막으로 Tm value를 잘 확인하시고 논문을 참고하셨다면 참고 논문의 장비, 시약, template 조건 등을 확인하시어 실험자의 조건을 잡아야할 필요가 있습니다.

도움이 될지는 모르겠으나 저도 그런 경험이 있어 몇자 적습니다.

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