어떤 방법으로 prep. 했나요?
양이 너무 적어서 잘안보이지만 밑에 보면 RNA가 보입니다.
위에 보이는 것은 RNA는 아닙니다.
RNA prep.방법에 대하여 질문하였습니다.
전기영동에 사용하는 dye 중에 위로 올라가는 dye(+charge)가 없을 겁니다.
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레벨1
뚭
(일반인)
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19.12.11 17:15
① Lyse samples and separate phases
1- 샘플(MCF10a No glucose 3h)에 400μl의 TRLzol을 넣고 pipetting을 하여 균질화 시킨다.
*샘플이 잘 용해되도록 여러 번 pipetting한다.
2- 상온에서 5분간 incubate 한다.
3- chloroform 80μl를 tube에 넣고, vortexing한다.
* chloroform이 팁에서 흐를 수 있기 때문에 주의한다.
4- 상온에서 3분간 incubate 한다.
5- 15000g로 설정된 Centrifuge에서 15분간 돌린다.
6- 맨 위 상층액만 따서 새 Microcentrifuge tubes에 넣는다.
*튜브를 기울여서, red phenol층과 interphase 층이 안들어가도록 주의해야 한다.
*chloroform을 첨가하면 3개의 층으로 나눠지게 되는데, 가장 아래쪽은 red phenol-chloroform, 중간은 interphase, 맨 위층은 colorless upper aqueous phase이다.
② Precipitate the RNA
1- 상층액만 옮김 튜브에, isopropanol 200μl을 넣고 vortexing한다.
2- 상온에서 10분간 incubate 한다.
3- 15000g로 설정된 Centrifuge에서 10분간 돌린다.
4- 상층액만 따서 버린다
③ Wash the RNA
1- 상층액만 버린 튜브에, 75% ethanol을 1mL 넣어주고, vortexing한다.
2- 9000g로 설정된 Centrifuge에서 10분간 돌린다.
3- 상층액만 따서 버린다.
4- 상온에서 5분간 뚜껑을 열고 클린배지에 둔다.
④ Solubilize the RNA
1- D.W 20μl를 넣고, vortexing을 많이 해 준 다음, 스핀다운 하고 ice에 보관한다.
2- 기계에 샘플 2.5μl를 넣고, RNA 양을 측정한다.
이렇게 진행하였습니다.
저분자 물질이고 (+) charge를 가지는 물질이sample에 오염되어 있으면
well위로 올라가서 tank buffer로 빠져 나갔을 겁니다.
gel을 보니 loading dye를 2종류 사용한것 같은데 어느정도 내렸는데도 well에
걸려있고 smear된 형태를 나타내는 것으로 봐서 RNA 추출 과정에 혼입된
고분자 불순물 같습니다.
RNA 추출을 좀더 깨끗히 해보는 것이 RNA양도 정상적으로 추출될 것 같고
불순물도 줄어들 것 같습니다.