Mg만 있으면 RIPA에서 작용 가능합니다.
처리양은 2~3U/ml정도 하면 됩니다.
RIPA 처리 후 바로 DNase 처리하면 됩니다.
초음파 세척기는 sonicator가 아니며 세척용의 약한 초음파 발생 장치입니다.
DNA 파괴가 일어나지 않습니다.
세포 별lystae의 점성은 cell양에 따라 달라질수도 있고 점성이 약하다고 lysis
효율이 낮은것은 아닙니다.
항상 실험할 때 cell 농도 별 lysate의 OD값을 측정해서 관리를 하는것이
좋습니다
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 11:37
항상 답변 감사합니다!
1. 혹시 지금 있는 DNase 1 를 농도에 맞춰서 사용해봐도 (효과가 있든, 없든) 상관은 없을까요...?
2. 옆 연구실에 ultrasonicator 있어서 사용을 하려고 하는데요. 얼음에 샘플 꽂아서 3초 정도 해주면 될까요..?
1. 혹시 지금 있는 DNase 1 를 농도에 맞춰서 사용해봐도 (효과가 있든, 없든)
상관은 없을까요...?
: Mg 2.5mM, Ca 0.5mM 농도가 필요하고 37도에서 30분 정도 처리하면 될것
같습니다.
2. 옆 연구실에 ultrasonicator 있어서 사용을 하려고 하는데요. 얼음에 샘플
꽂아서 3초 정도 해주면 될까요..?
: 30~40% power로 3~5초 처리해서 피펫으로 확인해 보고 부족하면 3초 정도 더
처리해 보세요.
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 13:40
답변 감사합니다.
1. RIPA buffer만 담아서 20, 50% power로 sonication을 해봤는데요. 두번 다 tube를 넘치지는 않지만 거품이 tube 끝까지 차오르던데요. 그냥 진행해도 괜찮을까요?? 거품은 시간이 지나면서 없어지고는 있습니다.
2. 모아 놓은 샘플들에다가 해보면 분명 거품이 생길텐데 사용하는 데 문제 없겠죠..?
시료 용기는 어떤걸 사용하고 용기 부피이 얼마나 시료가 차지하나요?
실험은 항상 정해진 방법으로 해야 하는 것도 있지만 상황에 맞게 진행해도
무방한 실험도 있습니다.
이런 경우 1초 on, 10초 off로 3~5 cycles을 해도 무방합니다.
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 14:27
답변 감사합니다.
1.5 mL micro-tube 이고, 샘플양이 약 600~700 uL 정도 예상되니 전체 40 mm정도 중에 20 mm 정도 깊이가 되는 듯 싶습니다.
동영상을 시청해보니깐 원래 거품이 생기긴 하는 것 같고, 거품이 생겨도 뚜껑이 닫히긴 하는데 어떻게 해야 할까요?
넘치지만 않으면 상관 없습니다.
원심분리하면 거품은 없어집니다.
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 19:48
답변 감사합니다ㅠㅠ 몇 가지 더 질문드려도 될까요..
1. 농도 계산할 때 lysate+lysis buffer (혹은 D.W)+ sample buffer 인 걸로 알고 있는데요. lysis buffer를 사용한다면 따로 PI 같은 거 안 넣고 그냥 RIPA buffer로만 하면 되는건가요??? 그리고 DW보다는 lysis buffer를 넣으라는 글을 보았는데 어떤 게 더 좋은건가요?
2. 상층액만 모아놓은 상태에서 소분하여 보관하는 것과 sample buffer, lysis buffer 를 넣어서 소분 보관하는 것, 이를 boiling 한 뒤에 소분하여 보관하는 것 중에 어느 것이 가장 좋은가요? 세번째의 경우 오랜 시간이 지나면 단백질량이 감소해서 결과가 조금 달라진다는 답변을 보았습니다. 저는 가급적이면 시간 딜레이 없이 진행하려고 하는데, 꼬일 것 같아서 웨스턴하는 텀이 며칠식 걸릴 수도 있으 것 같습니다..
3. 아직 정량은 하지 않았지만 보통 BCA할 때 standard로 BSA 2 mg/ml을 할 텐데, 샘플 단백질량이 범위를 넘어가도 직선식이니깐 그냥 계산하면 되나요?
선생님까지는 아니구요..ㅎ
1. 농도 계산할 때 lysate+lysis buffer (혹은 D.W)+ sample buffer 인 걸로 알고
있는데요.
: 무슨 농도 얘기인지요?
그리고 sample buffer라는 것은 전기영동 buffer인가요?
2. lysis buffer를 사용한다면 따로 PI 같은 거 안 넣고 그냥 RIPA buffer로만 하면
되는건가요???
: cell lysis 할때 목적 band에 따라 protease or phosphatase inhibtor를 RIPA 또는
lysis buffer에 넣고 lysis 시키면 됩니다.
3. DW보다는 lysis buffer를 넣으라는 글을 보았는데 어떤 게 더 좋은건가요?
: 세포 내에 있던 단백질이 세포외로 나왔을 때 안정화를 위해서는 DW 보다는
buffer가 좋습니다.
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 20:18
질문이 중간에 갑자기 올라가버렸네요..!
농도는 원하는 단백질 농도 (예를 들어 30 ug) 입니다! sample buffer라는 건 laemmli buffer 입니다. DW 대신에 volume 맞춰주기 위해 넣어주는 ripa buffer에 PI를 또 넣어야 하는지 여쭤보고 싶었습니다. 그냥 처음에 cell lysis하는 거 아니면 pi는 안 넣어줘도 되는거죠?!
loading 시료의 농도를 맞출때는 DW를 사용해야지 sample buffer 역할을
방해하지 않습니다.
PI를 넣지 않고 lysate를 만들었으면 전기영동 전에 PI를 넣는 것은 의미가
없습니다.
그러나 lysis 후 전기영동할 때까지 단백질에 변화가 있을 수도 있고 없을수도
있습니다.
시간나면 lysis때 PI를 넣은 것과 안넣은 것에 차이가 있는지 없는지 확인을
해보세요.
Lab마다, 연구자 마다 조금씩 다른점이 있더라구요.
저 같은 경우는 PI는 잘 사용안합니다.
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 20:31
1. 그렇다면 로딩 전에 lysate + laemmli buffer + DW (ripa buffer 대신에) 로 로딩할 단백질 농도를 맞추라는 말씀이신거죠?! 저는 우선은 cell lysis 할 때 ripa buffer에 pi를 넣어서 진행하였습니다. 시간이 나면 말씀대로 없이도 해서 차이를 확인해보도록 하겠습니다!
2. 상층액만 모아놓은 상태에서 소분하여 보관하는 것과 sample buffer, lysis buffer 를 넣어서 소분 보관하는 것, 이를 boiling 한 뒤에 소분하여 보관하는 것 중에 어느 것이 가장 좋은가요? 세번째의 경우 오랜 시간이 지나면 단백질량이 감소해서 결과가 조금 달라진다는 답변을 보았습니다. 저는 가급적이면 시간 딜레이 없이 진행하려고 하는데, 꼬일 것 같아서 웨스턴하는 텀이 며칠식 걸릴 수도 있으 것 같습니다..
3. 아직 정량은 하지 않았지만 보통 BCA할 때 standard로 BSA 2 mg/ml을 할 텐데, 샘플 단백질량이 범위를 넘어가도 직선식이니깐 그냥 계산하면 되나요?
1. 그렇다면 로딩 전에 lysate + laemmli buffer + DW (ripa buffer 대신에) 로 로딩할 단백질 농도를 맞추라는 말씀이신거죠?! 저는 우선은 cell lysis 할 때 ripa buffer에 pi를 넣어서 진행하였습니다. 시간이 나면 말씀대로 없이도 해서 차이를 확인해보도록 하겠습니다!
: 네..그렇게 해보세요.
2. 상층액만 모아놓은 상태에서 소분하여 보관하는 것과 sample buffer, lysis buffer 를 넣어서 소분 보관하는 것, 이를 boiling 한 뒤에 소분하여 보관하는 것 중에 어느 것이 가장 좋은가요? 세번째의 경우 오랜 시간이 지나면 단백질량이 감소해서 결과가 조금 달라진다는 답변을 보았습니다. 저는 가급적이면 시간 딜레이 없이 진행하려고 하는데, 꼬일 것 같아서 웨스턴하는 텀이 며칠식 걸릴 수도 있으 것 같습니다..
: WBT를 몇번 할 정도의 시료는 1회 전기영동양으로 소분해서 히팅 후
냉동보관(-18도)하면 될것 같고 남은 시료는 단백질이기 때문에 lysate
상태로 적당한 양 * 여러개로 나누어 냉동보관(-80도)하면 좋을 듯합니다.
3. 아직 정량은 하지 않았지만 보통 BCA할 때 standard로 BSA 2 mg/ml을 할 텐데, 샘플 단백질량이 범위를 넘어가도 직선식이니깐 그냥 계산하면 되나요?
: 가능한 STD curve에 들어가도록 희석해서 측정하세요.
한번측정 할 때 X5, X20 희석해서 측정해보세요
-
레벨5
n_jyoung92@naver.com
(대학원생)
-
19.12.11 20:58
어려움이 많았는데 정말 큰 도움이 되었습니다!! 다시 한번 감사드립니다!