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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 1789  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 western sample prep 질문입니다..
앞다리n_jyoung92@naver.com(대학원생)  |  2019.12.11 01:13

여러가지 찾아보면서 진행하려고 해도 혼자 처음 해보려니깐 막히는 게 한두가지가 아닌듯 합니다... 

웨스턴을 하려고 샘플 프렙을 하는데 질문이 있습니다.

 

1. 점성이 생겼을 때 DNase 1 을 이용하라는 답변이 있었는데요. 저희 연구실에 언제적 제품인지는 모르지만 promega의 RNA isolation kit 의 구성품인 것으로 추측되는 DNase 1 (Z358A) 제품이 있더라구요. 관련한 다른 구성품들은 온데간데 없고 해당 vial만 있습니다. certification도 따로 없는 듯 합니다. 겨우 찾아보니 nuclease-free water에 녹여 사용을 하고, 2-4 U/uL라고합니다. 다른 회사들의 DNase들을 보니깐 reaction buffer?, stop solution 등도 함께 사용하는 것을 보았습니다만 현재 제가 가지고 있는 DNase 1 vial는 단독으로 사용할 수 없는거겠죠..? 현재 동결건조 파우더 형태로 보관되어 있었고, 상온 저장이었습니다.

1-1 만약, 사용 가능하다면 어느 정도의 농도로 얼만큼을 넣어야 할까요..? 일반적으로 어느 정도 인지 궁금합니다. 속해 있는 kit 내에서는 x9 buffer와 함께 사용을 하는 듯 합니다. 

2. RIPA buffer를 넣고, cfg 한 뒤에 상층액을 옮기는 과정에서 점성때문에 힘들다 보니깐 질문을 드렸던 건데요. DNase 1을 정확히 어느 스텝에 사용하는건가요..? RIPA buffer를 넣고 ice 위에서 30분동안 유지할 때인가요, 혹은 점성이 있는 상층액을 옮긴 이후에 인가요? 

후자라면...상층액을 옮길 때 끈적임때문에 힘든 건 어쩔 수 없는건가요? 

3. sonication 답변도 해주셨는데, 저희 연구실에는 probe가 있는 기계가 아닌 water 에서 sonication 하는 기계밖에 없습니다. 저희 연구실에 있는 기계로 사용해도 되나요..? 온도 최대한 낮게 해서 가장 가장 파워로 3~5초 정도 하면 되는건가요?

 

+ 위와 같은 어려움을 겪었던 건 HaCaT cell 이었는데요. 조금 전에 HDF cell로 프렙하고 왔습니다. 그런데 HaCaT 때와 달리 상층액이 점성이 없었구요. 펠릿만 따로 건드려봐도 끈적임없이 하단부에 가라앉아 있었습니다. 다만 뿌옇게 하단에 있는 것으로 보아서 펠릿으로 생각이 되는데, 굉장히 얇게 벽에 붙어있는(?) 그런 상태였습니다.

HaCaT 때와 동일한 프로토콜로 진행을 했습니다. RIPA buffer를 이용했는데 상층액에 점성이 없었다면 세포가 파쇄가 잘 안되어 잘못 된 건가요?? 아니면 샘플로써 사용해도 괜찮은건가요??

#western blot
 
#sample prep
 
#웨스턴
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   

Mg만 있으면 RIPA에서 작용 가능합니다.

처리양은 2~3U/ml정도 하면 됩니다.

RIPA 처리 후 바로 DNase 처리하면 됩니다.

초음파 세척기는 sonicator가 아니며 세척용의 약한 초음파 발생 장치입니다.

DNA 파괴가 일어나지 않습니다.

세포 별lystae의 점성은 cell양에 따라 달라질수도 있고 점성이 약하다고 lysis

효율이 낮은것은 아닙니다.

항상 실험할 때 cell 농도 별 lysate의 OD값을 측정해서 관리를 하는것이

좋습니다

 

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

항상 답변 감사합니다!

1. 혹시 지금 있는 DNase 1 를 농도에 맞춰서 사용해봐도 (효과가 있든, 없든) 상관은 없을까요...?

2. 옆 연구실에 ultrasonicator 있어서 사용을 하려고 하는데요. 얼음에 샘플 꽂아서 3초 정도 해주면 될까요..?

대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   

1. 혹시 지금 있는 DNase 1 를 농도에 맞춰서 사용해봐도 (효과가 있든, 없든)

상관은 없을까요...?

: Mg 2.5mM, Ca 0.5mM 농도가 필요하고 37도에서 30분 정도 처리하면 될것

같습니다. 

2. 옆 연구실에 ultrasonicator 있어서 사용을 하려고 하는데요. 얼음에 샘플

꽂아서 3초 정도 해주면 될까요..?

: 30~40% power로 3~5초 처리해서 피펫으로 확인해 보고 부족하면 3초 정도 더

처리해 보세요.

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

답변 감사합니다.

1. RIPA buffer만 담아서 20, 50% power로 sonication을 해봤는데요. 두번 다 tube를 넘치지는 않지만 거품이 tube 끝까지 차오르던데요. 그냥 진행해도 괜찮을까요?? 거품은 시간이 지나면서 없어지고는 있습니다.  

2. 모아 놓은 샘플들에다가 해보면 분명 거품이 생길텐데 사용하는 데 문제 없겠죠..? 

대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   

시료 용기는 어떤걸 사용하고 용기 부피이 얼마나 시료가 차지하나요?

실험은 항상 정해진 방법으로 해야 하는 것도 있지만 상황에 맞게 진행해도

무방한 실험도 있습니다.

이런 경우 1초 on, 10초 off로 3~5 cycles을 해도 무방합니다.

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

답변 감사합니다. 

1.5 mL micro-tube 이고, 샘플양이 약 600~700 uL 정도 예상되니 전체 40 mm정도 중에 20 mm 정도 깊이가 되는 듯 싶습니다. 

동영상을 시청해보니깐 원래 거품이 생기긴 하는 것 같고, 거품이 생겨도 뚜껑이 닫히긴 하는데 어떻게 해야 할까요? 

대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

넘치지만 않으면 상관 없습니다.

원심분리하면 거품은 없어집니다.

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

답변 감사합니다ㅠㅠ 몇 가지 더 질문드려도 될까요..

1. 농도 계산할 때 lysate+lysis buffer (혹은 D.W)+ sample buffer 인 걸로 알고 있는데요. lysis buffer를 사용한다면 따로 PI 같은 거 안 넣고 그냥 RIPA buffer로만 하면 되는건가요??? 그리고 DW보다는 lysis buffer를 넣으라는 글을 보았는데 어떤 게 더 좋은건가요?

2. 상층액만 모아놓은 상태에서 소분하여 보관하는 것과 sample buffer, lysis buffer 를 넣어서 소분 보관하는 것, 이를 boiling 한 뒤에 소분하여 보관하는 것 중에 어느 것이 가장 좋은가요? 세번째의 경우 오랜 시간이 지나면 단백질량이 감소해서 결과가 조금 달라진다는 답변을 보았습니다. 저는 가급적이면 시간 딜레이 없이 진행하려고 하는데, 꼬일 것 같아서 웨스턴하는 텀이 며칠식 걸릴 수도 있으 것 같습니다..

3. 아직 정량은 하지 않았지만 보통 BCA할 때 standard로 BSA 2 mg/ml을 할 텐데, 샘플 단백질량이 범위를 넘어가도 직선식이니깐 그냥 계산하면 되나요?

대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   

선생님까지는 아니구요..ㅎ

1. 농도 계산할 때 lysate+lysis buffer (혹은 D.W)+ sample buffer 인 걸로 알고

있는데요.

: 무슨 농도 얘기인지요?

그리고 sample buffer라는 것은 전기영동 buffer인가요?

2. lysis buffer를 사용한다면 따로 PI 같은 거 안 넣고 그냥 RIPA buffer로만 하면

되는건가요???

: cell lysis 할때 목적 band에 따라 protease or phosphatase inhibtor를 RIPA 또는

lysis buffer에 넣고 lysis 시키면 됩니다.

3. DW보다는 lysis buffer를 넣으라는 글을 보았는데 어떤 게 더 좋은건가요?

: 세포 내에 있던 단백질이 세포외로 나왔을 때 안정화를 위해서는 DW 보다는

buffer가 좋습니다.

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

질문이 중간에 갑자기 올라가버렸네요..!

농도는 원하는 단백질 농도 (예를 들어 30 ug) 입니다! sample buffer라는 건 laemmli buffer 입니다. DW 대신에 volume 맞춰주기 위해 넣어주는 ripa buffer에 PI를 또 넣어야 하는지 여쭤보고 싶었습니다. 그냥 처음에 cell lysis하는 거 아니면 pi는 안 넣어줘도 되는거죠?!

대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   

loading 시료의 농도를 맞출때는 DW를 사용해야지 sample buffer 역할을

방해하지 않습니다.

PI를 넣지 않고 lysate를 만들었으면 전기영동 전에 PI를 넣는 것은 의미가

없습니다.

그러나 lysis 후 전기영동할 때까지 단백질에 변화가 있을 수도 있고 없을수도

있습니다.

시간나면 lysis때 PI를 넣은 것과 안넣은 것에 차이가 있는지 없는지 확인을

해보세요.

Lab마다, 연구자 마다 조금씩 다른점이 있더라구요.

저 같은 경우는 PI는 잘 사용안합니다.

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

1. 그렇다면 로딩 전에 lysate + laemmli buffer + DW (ripa buffer 대신에) 로 로딩할 단백질 농도를 맞추라는 말씀이신거죠?! 저는 우선은 cell lysis 할 때 ripa buffer에 pi를 넣어서 진행하였습니다. 시간이 나면 말씀대로 없이도 해서 차이를 확인해보도록 하겠습니다!

2. 상층액만 모아놓은 상태에서 소분하여 보관하는 것과 sample buffer, lysis buffer 를 넣어서 소분 보관하는 것, 이를 boiling 한 뒤에 소분하여 보관하는 것 중에 어느 것이 가장 좋은가요? 세번째의 경우 오랜 시간이 지나면 단백질량이 감소해서 결과가 조금 달라진다는 답변을 보았습니다. 저는 가급적이면 시간 딜레이 없이 진행하려고 하는데, 꼬일 것 같아서 웨스턴하는 텀이 며칠식 걸릴 수도 있으 것 같습니다..

3. 아직 정량은 하지 않았지만 보통 BCA할 때 standard로 BSA 2 mg/ml을 할 텐데, 샘플 단백질량이 범위를 넘어가도 직선식이니깐 그냥 계산하면 되나요?

대왕개구리SPEED  |  2019.12.11   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 그렇다면 로딩 전에 lysate + laemmli buffer + DW (ripa buffer 대신에) 로 로딩할 단백질 농도를 맞추라는 말씀이신거죠?! 저는 우선은 cell lysis 할 때 ripa buffer에 pi를 넣어서 진행하였습니다. 시간이 나면 말씀대로 없이도 해서 차이를 확인해보도록 하겠습니다!

: 네..그렇게 해보세요.

2. 상층액만 모아놓은 상태에서 소분하여 보관하는 것과 sample buffer, lysis buffer 를 넣어서 소분 보관하는 것, 이를 boiling 한 뒤에 소분하여 보관하는 것 중에 어느 것이 가장 좋은가요? 세번째의 경우 오랜 시간이 지나면 단백질량이 감소해서 결과가 조금 달라진다는 답변을 보았습니다. 저는 가급적이면 시간 딜레이 없이 진행하려고 하는데, 꼬일 것 같아서 웨스턴하는 텀이 며칠식 걸릴 수도 있으 것 같습니다..

: WBT를 몇번 할 정도의 시료는 1회 전기영동양으로 소분해서 히팅 후

냉동보관(-18도)하면 될것 같고 남은 시료는 단백질이기 때문에 lysate

상태로 적당한 양 * 여러개로 나누어 냉동보관(-80도)하면 좋을 듯합니다.

3. 아직 정량은 하지 않았지만 보통 BCA할 때 standard로 BSA 2 mg/ml을 할 텐데, 샘플 단백질량이 범위를 넘어가도 직선식이니깐 그냥 계산하면 되나요?

: 가능한 STD curve에 들어가도록 희석해서 측정하세요.

한번측정 할 때 X5, X20 희석해서 측정해보세요

앞다리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.11   

어려움이 많았는데 정말 큰 도움이 되었습니다!! 다시 한번 감사드립니다!

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