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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 PCR product를 Enzyme reaction했을 때 band가 자꾸 사라져서 질문 드립니다ㅠ
알pico(일반인)  |  2019.12.08 18:56
첨부파일 파일첨부: result.jpg (115 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요

cloning을 진행 중에 문제가 발생하여 질문 드립니다..

왼쪽 gel에서

마커를 제외하고 3번째 lane이 PCR product를 band isolation한 것이고

4번째 lane이  Enzyme reaction 한 PCR product입니다

Enzyme은 BamH1과 Hind3이고 reaction 시간은 3시간 30분 정도 진행하였습니다.

그런데 enzyme reaction 후 PCR product가 계속 4번째 lane 처럼 나옵니다 ㅠㅠ

 

4번 lane에 희미하게 형성 된 band가 있기는 한데.. size가 옆의

band isolation한 것과 동일하게 나와야 맞는데 더 위쪽에 퍼지게 생겨서

이게 맞는지 아님 다 날아간건지 도무지 모르겠어서 질문드립니다 ㅠㅠ

 

NEB cutter로 확인했을 때 PCR product sequence에 제가 사용한 enzyme site가 있지는 않았습니다

 

혹시 저처럼 PCR product가 enzyme reaction 후 계속 사라지거나 사진처럼

위쪽으로 퍼져서 밴드가 나오는 경우가 있나요..?? ㅠㅠ

실험 고수님들의 의견 부탁드립니다

#cloning
 
#pcr
 
#enzyme reaction
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리DTer  |  2019.12.25   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
제한효소가 DNA에 결합되어 그렇게 보일 뿐 문제는 아닙니다.
제한효소 처리 후 열처리하면 band shift 는 해결할 수 있습니다.
제한효소마다 열처리 조건은 다를 수 있으므로 제한효소 책자 참고하시면 됩니다.
꽃개구리느림보  |  2019.12.27   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

윗 분 말대로, DNA 크기가 작기 때문에 제한효소가 결합되어서 저렇게 나올 수 있음직 하네요. 열처리하기 전에 Loading dye에 SDS를 약간 첨가하고 열을 조금 가한 후에 걸어 보세요. 상용화된 제품들에는 6X 기준으로 SDS가 1% 정도 들어 있는 것 같습니다. 

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