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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 cell lysis 시에 RIPA buffer 후 질문입니다.
개구리n_jyoung92@naver.com(대학원생)  | 2019.12.06 20:09

안녕하세요. 웨스턴을 위해서 오늘 처음으로 RIPA buffer를 이용하여 HaCaT cell을 lysis 했습니다. 그런데 cfg 이후에 NP-40이나 Trizol을 사용했을 때와는 다르게 pellet이 완벽히 뭉쳐 가라 앉은 게 보이지가 않고, 끈적한 하얀색 실이 뭉쳐져 놓인 것과 같은 게 바닥쪽에 살짝 떠있었습니다. 옮기려고 하니 처음에 조금은 np-40이나 trizol 사용했을 때와 같이 맑은, 점성이 없는 액체였다가 어느 순간부터 RIPA buffer 정도의 살짝의 점성이 보여지기 시작했습니다. 바닥에 살짝 떠있는 하얀 실타래같은 애들은 피해서 최대한 옮기기는 했습니다. 사용해도 되는건가요.. 눈으로 층이 보이지 않습니다...

아래쪽 실타리 애들을 건드려보니깐 굉장히 끈적였습니다. 

ripa buffer 에 pi 넣고 cell에 분주한 뒤 얼음 위에서 30분간 lysis하고 13000rpm, 15 min 원심분리 했습니다. 

원래 RIPA buffer를 사용하면 이런가요...?  여쭤볼 곳이 없어서 질문 남깁니다..

#ripa buffer
 
#cell lysis
 
#pellet
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.12.06   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

점성이 있는 물질은 염색체 DNA입니다.

초음파를 조금 처리하면 DNA가 깨어져 점성이 없어지며 DNase I을 조금

처리해도 점성이 없어집니다.

개구리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.09   

답변 감사합니다. 확인이 너무 늦었습니다...

1. sonication 이나 DNase 를 넣어서 점성을 없애야 sample로써 사용할 수 있는건가요?? 지금 제가 취한 액체는 사용할 수 없는 건가요??

2. 저희 연구실에는 probe가 달린 ultrasonication이 아닌 물에서 진행하는 sonication 기계가 있기는 한데 이 기계를 이용해도 괜찮을까요??

개구리BlackSmile  |  2019.12.09   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

13000rpm로 Centrifuge를 하고 난 후에 상층액만 조심스럽게 땄다면 (원심분리를 하게 되면 DNA와 같은 점성이 있는 물질들은 tube 밑으로 가라앉음) 상층액을 사용해도 상관없습니다.

상층액을 Pipet으로 딴 후 loading할 때 실처럼 주~욱 늘어나는 느낌이 있다면 왠만하면 실험에 사용하지 않는 걸 추천드립니다. 점성 때문에 전기영동할 때 결과가 이상하게 나오는 경우가 많습니다.

DNase I를 처리하게 되면 DNA가 분해되면서 점성이 없어지므로 바로 실험에 사용할 수 있으니 참고해주세요.

개구리n_jyoung92@naver.com  |  2019.12.09   

답변 감사합니다!

1. DNase 1을 사용하면 안되는 세포도 따로 있나요? 저희 연구실은 인간 유래 피부세포인데 사용해도 무방할까요??

2. 제가 지금 컬렉해놓은 샘플에다가 사용하면 되나요?! 

3. 이후에 샘플 프렙 시 어느 단계에서 DNase1를 사용하는 건가요?

4. 어느 글에서 봤는데, 피펫으로 업다운해서 풀어주는 경우도 있다고 하는데 가능한가요?

5. 상층액을 조심스레 따는 것 말고, 반대로 실타래 같은 pellet을 먼저 피펫으로 빨아들여 제거한 후 컬렉을 하는 것도 괜찮을까요?? 

노하우가 있으시다면 부탁드립니다....

대왕개구리SPEED  |  2019.12.09   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. DNase 1을 사용하면 안되는 세포도 따로 있나요?

저희 연구실은 인간 유래 피부세포인데 사용해도 무방할까요??

: lysate에 처리하는 것이므로 세포와 관계가 없습니다.

2. 제가 지금 컬렉해놓은 샘플에다가 사용하면 되나요?! 

: 네..

3. 이후에 샘플 프렙 시 어느 단계에서 DNase1를 사용하는 건가요?

: RIPA 처리 후 또는 초음파 처리 후에 DNase를 반응을 하면 좋습니다.

4. 어느 글에서 봤는데, 피펫으로 업다운해서 풀어주는 경우도 있다고 하는데

가능한가요?

: 크게 점성이 줄지는않습니다.

염색체가 짧은 단편으로 잘려야 점성이 사라집니다.

5. 상층액을 조심스레 따는 것 말고, 반대로 실타래 같은 pellet을 먼저 피펫으로

빨아들여 제거한 후 컬렉을 하는 것도 괜찮을까요?? 

:  큰 점성은 제거가 가능해도 부분적으로 퍼져있기 때문에 lysate loss를 감안

하면 어느정도 제거가 가능합니다.

하지만 조금이라도 점성있는 단편이 lysate에 들어 있으면 SDS-PAGE 할때

방해를 줍니다.

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