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질문 ht 29 세포 stock제조와 관련하여
올챙이ㄷㅎㅅ0328(대학생)  |  2019.12.05 17:19

안녕하세요 ht 29를 분양받아 실험을 진행하였습니다.

실험이 끝나가서 이제 stock을 만들려고 하는데

저희 실험실 stock 제조하는 프로토콜이 잘못되었는지 stock을 제조 후 다시 activation을 시키면 세포들이 다 죽어있습니다.

저희 프로토콜이 잘못되었는지 여쭙고 싶습니다.

1. fbs를 넣지않은 rpmi 1640 95%와 DMSO 5%를 섞어 preservation media 미리 제조한다.

2. HT 29 cell plate에 trypsin edta를 3ml 넣고 incubator에 약 10분간 배양한다.

3. 세포가 다 떼어진 것을 확인하고 growth media 7ml를 넣고 5분간 centrifuge한다.

4. 세포 pellet에 닿지않게 배지를 석션한다.

5. preservation media 3ml를 넣고 현탁해준다.

6. cryotube에 1ml씩 넣는다.

7. isopropanol이 들어있는 cell freezing container에 cryotube를 넣고 약 -50도인 freezer에 24시간 넣어놓는다.

8. 24시간 뒤 액체 질소에 넣는다.

 

저희 실험실 프로토콜에 문제가 있는지 알 수있을까요....??자꾸 보존에 문제가 생겨 이렇게라도 여쭤봅니다. 

혹시 다른 preservation protocol이 있으시다면 알려주시면 정말 감사할 것 같습니다. 읽어주셔서 감사합니다

#ht 29
 
#cell
 
#preservation
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2019.12.05   

진행 프로토콜상 큰 문제는 없어 보이네요...
근데 DMSO는 10%를 이용해보세요. 일반적으로 10% DMSO를 사용합니다.

그리고도 동결이 너무 안되면...

1. 90% FBS + 10% DMSO를 동결 용액으로 사용해보세요.

2. freeze tank에 isopropanol을 교체하세요.

3. 질소탱크에 들어가기전에 셀을 녹여서 보세요. 이때 살아야 질소탱크안에서도 보관이 의미가 있습니다.

올챙이ㄷㅎㅅ0328  |  2019.12.05   

저도 왜인지는 모르겠지만 fbs넣지 않은 rpmi로 배지를 만들라고 배웠는데 fbs넣은 배지로 한번 만들어봐야겠습니다. 답변 감사합니다

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