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질문 Plasmid DNA bands 함께 확인 부탁드립니다..ㅠㅠ
올챙이팡이(대학원생)  | 2019.11.29 17:30
첨부파일 파일첨부: plasmid DNA bands.PNG (775 KB)
이미지 첨부파일

 

Plasmid쪽 실험을 아직 오래 해보지 않아서 고수님들께 의견 좀 구해보려 합니다.

 

Plasmid DNA extraction kit를 사용해서 plasmid DNA를 뽑았습니다.

그리고 바로 전기영동에 6 ul씩 걸어서 밴드를 확인했구요.

총 2개의 균주를 3번씩 반복해서 밴드 사진이 3개씩 동일합니다.

 

궁금한 점은..

왼쪽 3개의 bands 는 plasmid농도가 나오긴 했는데..  (331 ng/ul)

전기영동을 해보면 bands는 안나오고 smearing 현상만 보여요..ㅠㅠ plasmid가 아닌 게 뽑혀서 저렇게 나오는건지. 뭔지 잘 감이 안옵니다..

중앙에 3개씩 밴드가 나온 균주는 농도가 103.85 ng/ul로 첫번째 균주보다 좀 더

낮게 나왔음에도 불구하고 밴드가 잘 나왔거든요...

 

다들 하루하루 연구하시느라 고생 많으시겠지만,

작은 조언이라도 해주시면 감사드리겠습니다.^^

 

 

 

 

#Plasmid DNA
 
#Electrophoresis bands
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2019.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

농도도 중요하지만 실제 전기영동을 해서 plasmid pattern을 확인하는 것도 중요

합니다.

왼쪽 3개는 다시 prep.해 보는것이 좋을 듯하고 오른쪽 3개는 제한효소로 자라서

원하는 plasmid인지 확인해 보세요.

대왕개구리강시  |  2019.11.29   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

우선 plasmid 정제를 다시 해야 합니다.

왼쪽 3개는 plasmid 없는것 같구요. 오른쪽 3개는 plasmid가 뽑히기는 했으나 역시 다시 뽑아야 합니다.

아래쪽 밴드 두개는 plasmid가 맞으나 맨 위 두꺼운 밴드는 gDNA 입니다.

마커는 아마도 Lambda/HindIII 인것 같은데 맨 위 밴드가 24kb이며 그보다 더 위에 밴드가 있는것은 gDNA라는 의미입니다.

먼저 건 세 개의 시료는 plasmid가 없습니다.

 

다음에 plasmid를 뽑을때는 Sol2 처리할때 최대한 부드럽게 섞으세요. 그래야 gDNA가 최소한으로 오염되며, Sol2 단계에서 tube를 막 험하게 섞으면 섞을수록 gDNA 오염이 심해집니다.

Sol3 단계도 마찬가지로 부드럽게 섞어야 합니다.

올챙이팡이  |  2019.12.02   

답변해주셔서 감사드립니다~~~~!!

 

한 가지 더 질문을 해도 될까요~?

 

일단 답변해주신 내용대로 HIND III 마커를 이용한게 맞습니다.

저는 plasmid DNA extraction kit로 뽑았으니 중앙에 나온 3개의 밴드가 모두

 

플라스 미드라고 생각했었는데 gDNA라니.. 제가 프렙 도중에 튜브 핸들링을

 

잘 못해서 gDNA에 오염이 된 것이라고 생각하면 될까요?

 

그리고 마커 윗부분에 뜬 밴드는 gDNA라고 하셨는데 그 이유가.. 뭔지

 

잘 모르겠습니다.  답변 부탁드려요. 감사합니다.^^

대왕개구리SPEED  |  2019.12.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

plasmid prep. kit에서 gDNA가 나오는 경우는 거의 없습니다.

하지만 위치를 봐서 제일 위의 band는 gDNA 위치와 비슷합니다.

그러나 band양이 너무 많기 때문에 gDNA가 아니라고도 보입니다.

- 그리고 마커 윗부분에 뜬 밴드는 gDNA라고 하셨는데 그 이유가..

: gDNA를 분리해서 전기영동 하면 비슷한 위치에 나옵니다.

따라서 plasmid DNA는 무조건 분리 후 제한효소로 잘라서 확인을 해야 합니다.

왼쪽3개 lane이 plasmid가 확실히 있는 균이라면 gDNA가 분해된것일 수도

있기 때문에 kit에 문제가 있을 가능성도 있습니다.

kit의 용액을 정확히 처리해서 다시 분리해 보세요.

 

올챙이팡이  |  2019.12.02   

감사합니다.

말씀해주신대로 다시 진행해보려고 합니다. ^^

 

감기조심하세요!

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