실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
투석 중 침전물 발생은 어떻게 해결해야할까요?
레벨4 졸업은언제하나 (대학원생)
안녕하세요^^
현재 대장균에서 단백질 발현 후 IMAC (Ni-NTA레진)정제까지 완료하였습니다.
Eluate에서 imidazole을 제거하기위해 투석을 진행하였는데요..
투석을 진행하면서 농축도 하고 싶어서 DW에 투석 후 (약 45 ml 정도 됨) 동결건조를 시켰습니다.
그런데 투석 후에 용액 내에서 흰색 침전물이 둥둥 떠다니는 것을 확인해서,
투석을 끝내고 동결건조 후 2 ml PBS에 녹여봤는데 맑은색이아니라 완전히 녹지 못 한 것 같은 뿌연 용액(?)이 되었습니다.
(spin filter를 사용해봤는데, filter 밑으로 다 빠져나가서 투석으로 전환하였습니다. 원인은 찾지 못 했습니다.)
일단 aggregation된 것인지 어떤 것인지 확인하려고 SDS-PAGE와 WB을 진행하였습니다.
SDS-PAGE에서는 target band (10 kD)이외의 impurity band를 확인할 수 있었고 (농축을 한 것인데도 target band는 더 늘어나지 않음),
WB 결과에서는 정제 전과 정제 후에서 target band 와 이의 dimer를 확인하였는데, 투석 후 농축한 sample에서는 dimer가 아니라 Oligmer? (aggregate)를 확인하였습니다.
제 target peptide의 solubility의 문제때문에 생긴 침전인 것 같은데,
PBS 이외에 다른 buffer로 녹여서 다시 SDS-PAGE를 진행 후 확인해보아야하는 것인지 잘 모르겠어서 문의드립니다.
아니면 PBS를 더넣고 소니케이션 같은 것으로 aggregate을 풀어줘야하는 것인지요.. ㅠ ㅠ
이제 정제 다 했으니까 버퍼 바꾸고 농축 해서 분석 기기로 분석하면 되겠다 ^^ 싶었는데...
이렇게 와장창창창 샘플이 문제가 생길 줄은 몰랐기레 ㅠㅠ
어떻게 해야할지 막막하네요 ㅠㅠ
항상 감사합니다!
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